باکتری ها گرم مثبت و منفی و طریقه رنگ آمیزی آنها

باکتریها گروهی از موجودات تک سلولی ذره بینی هستند که پوشش بیرونی نسبتا ضخیمی آنها را احاطه کرده است. این موجودات ساختار ساده ای دارند و به گروه جانداران ساده) پروکاریوت (تعلق دارند. باکتریها متنوع ترین و مهمترین میکروارگانیسمها هستند. تعداد کمی از آنها در انسان و حیوانات و گیاهان بیماری زا است .بطور کلی بدون فعالیت آنها، حیات بر روی زمین مختل میگردد. بطور یقین یوکاریوتها از موجودات زنده باکتری مانند بوجود آمده اند.

 ساختمان باکتری ها

باکتریها هسته ی سازمان یافته ندارند و DNA و پروتئینهای همراه آن درون ناحیه هسته مانندی با نام ناحیه نوکلئوتیدی قرار گرفته اند و اجزای سلولی آنها در سیتوپلاسم پراکنده اند. کروموزمهای غیر مشابه و جداگانه در آنها وجود ندارد. در باکتریها، واکوئل دیده نمیشود. بیشتر آنها بدون کلروفیل هستند و متابولیسم خود را از راه شیمیوسنتز انجام میدهند. باکتریها به دلیل اینکه هسته سازمان یافته و مشخصی ندارند میوز و میتوز و تولید مثل جنسی نمیکنند. تنها نوع تقسیم سلولی در آنها تقسیم دوتایی است که آن نیز پس از همانندسازی و مضاعف شدن کروموزومها صورت می گیرد .

انواع باکتریها باکتریها براساس رنگ آمیزی  )گرم منفی یا مثبت بودن( ، شکل باسیل، کوکسی و اسپیروکت، متابولیسم ) بیهوازی ، هوازی ، بیهوازی اختیاری و …( تقسیم بندی می شوند.

باکتری گرم منفی

شامل گروهی از باکتریها است که به دلیل نوع دیواره آنها در هنگام رنگ آمیزی گرم توانایی جذب کریستال ویوله را نداشته و در مرحله دوم رنگ آمیزی که سافرانین ) با فرمول (Cl4N19H20اضافه میشود، آنرا سرخ یا صورتی نشان می دهد. این بخاطر وجود غشای خارجی است که از نفوذ رنگ جلوگیری میکند. در مقایسه با باکتریهای گرم مثبت، گرم منفی ها به خاطر دیواره نفوذ ناپذیرشان به آنتی بیوتیکها مقاومترند.

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی

  1. باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
  2. گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود، پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت. یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم مثبت، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
  3. باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
  4. باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری، هضم و متلاشی شده آن می شوند.

رنگ آمیزی گرم

(Gram staining) یکی از مهمترین و متداولترین روشهای رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم میشوند. رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد .در رنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتریهای گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده میشود .گرچه هر دو گروه یعنی باکتریهای گرم مثبت و منفی دارای دیواره می باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت لایه ی ضخیمی از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتریهای گرم منفی ضخامت آن به حداقل میرسد .

روش رنگ آمیزی گرم

پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند: نخست رنگ کریستال ویوله با فرمول C25N3H30Cl را به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتریها به رنگ بنفش درخواهد درآمد .پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول )خنثی نمودن( PH  به مدت ۳۰ تا  ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده و ایجاد کمپلکسهایی می نماید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری میشود. پس از این مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده میشوند.

مرحله رنگ زدایی

مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشوی لام با آب، لام به مدت ۱۵ تا ۲۰ ثانیه در معرض مواد رنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد. در باکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدوگلیکان محدود و غشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها و غشا میگردد و باکتری رنگ مراحل قبل را ازدست می دهد. ولی در باکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل از غشا خارج نمی شود .در نتیجه پس از این مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .در انتها سطح فروتی را با سافرانین با فرمول (C20H19N4Cl) یا فوشین ) قرمز رنگ ( به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس با آب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد. در این مرحله باکتریهای بی رنگ )باکتریهای گرم منفی( به رنگ قرمز یا صورتی درمی آیند و باکتریهای بنفش یا آبی (باکتریهای گرم مثبت(  بدون تغییر رنگ باقی میمانند.

تصویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری گرم منفی.

پوشش سلولی گرم منفی ها

پوشش سلولی گرم منفی ها یک ساختمان چندلایه ای و بسیار پیچیده می باشد ) غشای سیتوپلاسمی ( که در باکتریهای گرم منفی، غشای داخلی نامیده می شود به وسیله یک ورقه مسطح از پپتیدوگلیکان پوشیده می شود که یک لایه پیچیده به نام غشای خارجی به آن متصل می گردد. یک کپسول خارجی یا لایه S نیز ممکن است وجود داشته باشد. فضای بین غشای داخلی و خارجی به نام فضای پری پلاسمیک نامیده می شود .

پوشش سلولی گرم مثبت ها

پوشش سلولی گرم مثبتها نسبتا ساده بوده و از دو تا سه لایه تشکیل شده است: غشای سیتوپلاسمی، یک یا چند لایه پپتیدوگلیکان ضخیم، و در بعضی باکتریها یک لایه به نام کپسول باکتری یا یک لایه S در خارج وجود دارد .

تصویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری گرم مثبت.

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی

  1. باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
  2. گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود، پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت. یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم مثبت، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
  3. باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
  4. باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری، هضم و متلاشی شده آن می شوند.

 رنگ آمیزی گرم

(Gram staining) یکی از مهمترین و متداولترین روشهای رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم میشوند. رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد .در رنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتریهای گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده میشود .گرچه هر دو گروه یعنی باکتریهای گرم مثبت و منفی دارای دیواره می باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت لایه ی ضخیمی از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتریهای گرم منفی ضخامت آن به حداقل میرسد .

 روش رنگ آمیزی گرم

پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند: نخست رنگ کریستال ویوله با فرمول C25N3H30Cl را به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتریها به رنگ بنفش درخواهد درآمد .پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول )خنثی نمودن( PH  به مدت ۳۰ تا  ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده و ایجاد کمپلکسهایی می نماید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری میشود. پس از این مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده میشوند.

 

مرحله رنگ زدایی

مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشوی لام با آب، لام به مدت ۱۵ تا ۲۰ ثانیه در معرض مواد رنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد. در باکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدوگلیکان محدود و غشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها و غشا میگردد و باکتری رنگ مراحل قبل را ازدست می دهد. ولی در باکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل از غشا خارج نمی شود .در نتیجه پس از این مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .در انتها سطح فروتی را با سافرانین با فرمول (C20H19N4Cl) یا فوشین ) قرمز رنگ ( به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس با آب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد. در این مرحله باکتریهای بی رنگ )باکتریهای گرم منفی( به رنگ قرمز یا صورتی درمی آیند و باکتریهای بنفش یا آبی (باکتریهای گرم مثبت(  بدون تغییر رنگ باقی میمانند.

تصاویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری های گرم منفی و گرم مثبت.