باکتری ها گرم مثبت و منفی و طریقه رنگ آمیزی آنها

باکتری ها گروهی از موجودات تک سلولی ذره بینی هستند که پوشش بیرونی نسبتا ضخیمی آنها را احاطه کرده است. این موجودات ساختار ساده ای دارند و به گروه جانداران ساده (پروکاریوت) تعلق دارند. باکتری ها متنوع ترین و مهمترین میکروارگانیسم ها هستند. تعداد کمی از آنها در انسان و حیوانات و گیاهان بیماری زا است. بطور کلی بدون فعالیت آنها، حیات بر روی زمین مختل میگردد. بطور یقین یوکاریوت ها از موجودات زنده باکتری مانند بوجود آمده اند.

شکل1: تصویری از باکتری ها

 ساختمان باکتری ها

باکتری ها هسته ی سازمان یافته ندارند و DNA و پروتئین های همراه آن درون ناحیه هسته مانندی با نام ناحیه نوکلئوتیدی قرار گرفته اند و اجزای سلولی آنها در سیتوپلاسم پراکنده اند. کروموزم های غیر مشابه و جداگانه در آنها وجود ندارد. در باکتری ها، واکوئل دیده نمی شود. بیشتر آنها بدون کلروفیل هستند و متابولیسم خود را از راه شیمی و سنتز انجام میدهند. باکتری ها به دلیل اینکه هسته سازمان یافته و مشخصی ندارند میوز و میتوز و تولید مثل جنسی نمی کنند. تنها نوع تقسیم سلولی در آنها تقسیم دوتایی است که آن نیز پس از همانندسازی و مضاعف شدن کروموزوم ها صورت می گیرد .

شکل 2: اجزا سلول باکتری

انواع باکتری ها براساس رنگ آمیزی گرم منفی یا مثبت بودن؛ شکل باسیل، کوکسی و اسپیروکت، متابولیسم بیهوازی، هوازی، بیهوازی اختیاری و … تقسیم بندی می شوند.

خصوصیات باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

1. باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
2. گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود، پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت. یعنی در لام های رنگ آمیزی شده گرم مثبت، باکتری های گرم منفی هم دیده می شود اما در لام های گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتری های گرم مثبت دیده نمی شوند.
3. باکتری های گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
4. باکتری های گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری، هضم و متلاشی شده آن می شوند.

پوشش سلولی گرم منفی ها

پوشش سلولی گرم منفی ها یک ساختمان چندلایه ای و بسیار پیچیده می باشد (غشای سیتوپلاسمی) که در باکتری های گرم منفی، غشای داخلی نامیده می شود به وسیله یک ورقه مسطح از پپتیدوگلیکان پوشیده می شود که یک لایه پیچیده به نام غشای خارجی به آن متصل می گردد. یک کپسول خارجی یا لایه S نیز ممکن است وجود داشته باشد. فضای بین غشای داخلی و خارجی به نام فضای پری پلاسمیک نامیده می شود .

پوشش سلولی گرم مثبت ها

پوشش سلولی گرم مثبت ها نسبتا ساده بوده و از دو تا سه لایه تشکیل شده است: غشای سیتوپلاسمی، یک یا چند لایه پپتیدوگلیکان ضخیم، و در بعضی باکتری ها یک لایه به نام کپسول باکتری یا یک لایه S در خارج وجود دارد .

رنگ آمیزی گرم

(Gram staining) یکی از مهمترین و متداولترین روش های رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است که اولین بار توسط کریستین گرم ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری ها بر مبنای رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم میشوند. رنگ باکتری پس از رنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول و به عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد .در رنگ آمیزی گرم باکتری های گرم مثبت پس از رنگ آمیزی به رنگ بنفش و باکتری های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده میشود .گرچه هر دو گروه یعنی باکتری های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری های گرم مثبت لایه ضخیمی از پپتیدوگلیکان است، ولی در باکتری های گرم منفی ضخامت آن به حداقل میرسد .

شکل 3: تصویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری گرم منفی.

روش رنگ آمیزی گرم

پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند: نخست رنگ کریستال ویوله با فرمول C25N3H30Cl را به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتری ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد .پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول (خنثی نمودن PH ) به مدت ۳۰ تا  ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده و ایجاد کمپلکس هایی می نماید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری میشود. پس از این مرحله، همه باکتری ها کماکان به رنگ بنفش مشاهده میشوند.

شکل 4: تصویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری گرم مثبت.

مرحله رنگ زدایی

مهمترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشوی لام با آب، لام به مدت ۱۵ تا ۲۰ ثانیه در معرض مواد رنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد. در باکتری های گرم منفی که دارای لایه های پپتیدوگلیکان محدود و غشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها و غشا میگردد و باکتری رنگ مراحل قبل را ازدست می دهد. ولی در باکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایه پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل از غشا خارج نمی شود .در نتیجه پس از این مرحله باکتری های گرم منفی بی رنگ ولی باکتری های گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .در انتها سطح فروتی را با سافرانین با فرمول (C20H19N4Cl) یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می پوشانیم سپس با آب شستشو داده و پس از خشک شدن با میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گیرد. در این مرحله باکتری های بی رنگ (باکتریهای گرم منفی) به رنگ قرمز یا صورتی درمی آیند و باکتری های بنفش یا آبی (باکتری های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی میمانند.

شکل 5: تصاویر مربوط به رنگ آمیزی باکتری های گرم منفی و گرم مثبت.