طراحی پرایمر

طراحی پرایمر

یکی از مهمترین اجزای فرآیند PCR پرایمرها هستند. در روش PCR پس از باز شدن زنجیره های DNA در چرخه حرارتی، هر زنجیره به عنوان ناحیه هدف برای سنتز DNA استفاده می شود. پس از آن از یک جفت پرایمر که یک توالی از DNA تک رشته ای می باشند، استفاده می شود. در حقیقت از دو پرایمر که به آنها الیگونوکلئوتید نیز می گویند، برای محدود کردن ناحیه هدفی که می خواهیم تکثیر صورت بگیرد، استفاده می شود. پرایمر سمت چپ مکمل یک رشته DNA و پرایمر راست مکمل DNA در انتهای ناحیه هدف است.

به صورت دقیق تر پرایمر ها DNA های تک رشته ای و کوتاهی هستند که عموما از هجده تا بیست و چهار باز آلی تشکیل می شوند. پرایمرها نقطه آغازین فرآیند سنتز DNA را تعیین می کنند و از طریق پیوند هیدروژنی به DNA تک رشته ای وصل می شوند. در داخل سلول ها، رشته های کوتاه RNA نقش آغازگر را ایفا می کنند. پس برای فرآیند PCR پس از اینکه ژن را تعیین کردیم باید پرایمرها طراحی شوند. برای تولید پرایمرها از آنزیم پریماز استفاده می شود. این آنزیم از دسته RNA پلیمرازها است. به این دلیل وجود پرایمر ضروری است که آنزیم DNA پلیمراز که در فرآیند DNA، PCR را سنتز می کند، تنها قادر است که نوکلئوتیدها را به رشته های DNA متصل کند و نه DNA های تک رشته ای. محدوده بین دو پرایمر توسط DNA پلیمراز پر می شود ( به پرایمرها، پرایمرهای Forward و Reverse میگوییم). در نهایت این پرایمرها باید قبل از پایان یافتن سنتز DNA حذف شوند. پس طراحی پرایمرها باید به دقت انجام شوند. تولید آنها به صورت تخصصی صورت می پذیرد تا به صورت دقیق بر روی توالی DNA های تک رشت های وصل شوند. همچنین از این پرایمرها برای تعیین توالی نیز استفاده می شود. DNA پلیمراز یا آنزیم Taq پلیمراز از طریق سر زنجیره OH-3 پرایمر به آن متصل می شود. تصویری ازدو پرایمر متصب شده به تک رشته DNA در شکل زیر مشاهده می شود.

مشخصات پرایمر های تولید شده باید بهینه باشند. طول آنها نباید از حدی کوچکتر باشند تا اتصال غیر تخصصی باشد یا بزرگتر باشد تا دمای فرآیند آنیلینگ مورد نیاز را بالا ببرد که نتیجه آن افزایش احتمال محصولات نامطلوب است. طول بهینه معمولا در باز ۱۹ تا ۲۴ نوکلئوتید است. همچنین باید به دمایی که در آن DNA ذوب یا بیشتر رشته ها از هم جدا می شوند نیز توجه کرد تا ساختارهای نامطلوب تولید نشوند. همچنین باید به جایگاه انتخاب پرایمر و غلظت آن نیز توجه کامل شود.