الکتروفورز افقی و عمودی

الکتروفورز افقی و عمودی

در خدمات الکتروفورز افقی (ژل آگارز) و عمودی (پلی آکریل آمید)  می توان پروتئین ها و  محصولات بدست آمده از PCR را با توجه به نقطه ایزوالکتریک، وزن مولکولی، بار الکتریکی یا ترکیبی از این فاکتورها از هم جدا می شوند. طبیعت جداسازی به نوع ژل به کار رفته و فرآیند تیمار بستگی دارد. یکی از مرسوم ترین روش ها استفاده از  ژل های پلی اکریل آمیدی و SDS یا سدیم دودسیل سولفات است که به آن اصطلاحا SDS-PAGE می گویند. در این روش پلی پپتیدها از طریق یک عامل کاهنده قوی تیمار گشته تا ساختار سوم و چهارم خود را از دست دهند و در نتیجه بر اساس وزن مولکولی می توانند جدا شوند. پروتئین ها توسط سدیم دودسیل سولفات از بارهای منفی پوشیده می شوند و سپس از طریق ژل پلی آکریل آمید به سمت الکترود مثبت حرکت می کنند. پروتئین های کوچکتر با سرعت بیشتری از ژل عبور می کنند و در نتیجه پروتئین ها را بر اساس اندازه شان (که بر اساس کیلودالتون معمولا بیان می شوند) می توان تفکیک کرد. ژل ها با استفاده از پلیمرهای اکریل آمید و بیس - آکریل آمید که به صورت اتصالات عرضی میان زنجیره های پلیمری قرار گرفته اند و منافذ با قطر معین و یکسان در ژل ایجاد می کند، ساخته می شوند.

رزولوشن ژل و روش را غلظت اکریل آمید تعیین می کند. برای پروتئین ها با وزن مولکولی بالا، غلظت های پایین تر اکریل آمید رزولوشن بهتری را ایجاد می کند. نسبت اکریل آمید به بیس - آکریل  آمید نیز موثر است. میزان بالاتر بیس - آکریل آمید، اتصالات عرضی بین پلیمری بیشتر شده و در نتیجه اندازه منافذ کاهش می یابد. اگر پروتئین مورد آنالیز اندازه بزرگتری داشته باشد، از ژل با منافذ بزرگتر باید استفاده کرد و بالعکس برای پروتئین های کوچک منافذ را کوچک در نظر گرفت. در نهایت نمونه را در چاهک های ژل بارگذاری می کنند و معمولا یکی از آنها را برای مارکر یا لدر (ladder) در نظر می گیرند. لدر مخلوطی از پروتئین ها با وزن مولکولی مشخص است و پس از رنگ آمیزی به صورت باندهای رنگی قابل مشاهده است. پس از اعمال ولتاژ، پروتئین ها با سرعت های متفاوت با توجه به اندازه آنها حرکت می کنند که سرعت های متفاوت باندهای محتلفی را در هر مسیر به وجود می آورند. امکان تهیه ژل های دو بعدی نیز وجود دارد. بدین طریق که پروتئین ها با توجه به نقطه ایزوالکتریک یا PZC (نقطه ای که بار آنها صفر یا خنثی است) خود در بعد اول و با توجه به وزن مولکولی در بعد دوم تفکیک می شوند.

تکنیک الکتروفورز ژل آگاروز همچنین برای تفکیک تکه های DNA یا RNA و عموما پس از انجام PCR نیز بسیار مورد استفاده قرار می گیرد. تکه های DNS نیز به دلیل گروه های فسفاتی خود، بار منفی داشته و با اعمال ولتاژ از طریق ژل به سمت الکترود مثبت حرکت می کنند. این تکه ها نیز بر اساس اندازه و وزن مولکولی خود در ژل تفکیک می شوند. در نهایت محصولات با رنگ های شیمیایی همچون اتیدیوم بروماید، متیلن بلو یا کارولینابلو به شکل باند قابل رویت می شوند. مقایسه باند ظاهر شده با یک استاندارد وزن مولکولی میزان موفقیت واکنش در PCR را آشکار می سازد. این روش مطالعه DNA هم همچنین در مطالعات گسترده ای در حوزه ژنتیک و مطالعات برون تنی مورد استفاده قرار می گیرد. روند تزریق نمونه در چاهک ها و جداسازی DNA ها در شکل شماتیک بالا نشان داده شده است. برای اطلاعات بیشتر می توانید به کتاب "مقدمه ای بر روش های ارزیابی در مهندسی بافت" انتشارات جهاد دانشگاهی مراجعه کنید.