آنالیز HPLC

آنالیز HPLC

آنالیز HPLC : آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا High Performance Liquid Chromatograph که به آنالیز HPLC معروف است. یکی از پرکاربردترین و سریع‌ترین روش‌های جداسازی محلول‌های مایع است. برخلاف روش کروماتوگرافی گازی که در آن ماده ورودی به ستون جدایش باید به صورت گازی باشد، در کروماتوگرافی مایع، خود محلول مایع می‌تواند مستقیماً وارد ستون شود. از این رو برای بررسی محلول‌هایی که فرار نیستند و یا محلول‌هایی که به دما حساس هستند باید از کروماتوگرافی مایع (LC) استفاده کرد. در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) محلول را به همراه یک حلال با یک پمپ فشار بالا وارد ستون جدایش می‌شود.

ستون جدایش با مواد متخلخل و یا لایه‌ای پرشده است. برای عبور دادن محلول از داخل ستون معمولا به فشار زیادی نیاز است از این رو به این روش کروماتوگرافی مایع با فشار بالا نیز گفته می‌شود. درون ستون ترکیبات مختلف با سرعت‌های متفاوتی عبور می‌کنند زیرا میزان چسبندگی، نوع و قدرت پیوندی که هر مولکول با فاز ثابت درون ستون ایجاد می‌کند متفاوت است. به همین دلیل زمانی که طول می‌کشد تا هر مولکول از ستون خارج شود مقداری مشخص است. البته این زمان وابسته به نوع ستون و شرایط آزمایشی است که دستگاه آنالیز HPLC با آن کار می‌کند.

باید برای اطمینان از شناسایی دقیق و اندازه گیری مقدار این ترکیب باید نمونه استاندارد و معلوم از این ترکیب تهیه شود و این نمونه یک بار با شرایط محلول اصلی توسط همان دستگاه HPLC و با همان شرایط تست شود.

روش‌ اندازه‌گیری کیفی در آنالیز HPLC

زمانی که طول می‌کشد هر مولکول از ستون دستگاه آنالیز HPLC عبور کند و به آشکارساز برسد، زمان بازداری (Retention Time) نامیده می‌شود. زمان بازداری برای هر مولکول مقداری منحصر به فردی است از این رو ابتدا لازم است مقداری از محلول استاندارد (معمولا ترکیب خالص از ماده مورد نظر است) ترکیبی را که به دنبال شناسایی آن هستیم را وارد دستگاه کنیم و زمان بازداری آن را اندازه گیری کنیم و سپس نمونه‌های مجهول را بررسی کنیم اگر در نمونه مجهول پیکی با زمان بازداری مشابه مشاهده شود می‌توان گفت که این پیک مربوط به همان ترکیب استاندارد است.

برای تعیین چندین ترکیب در یک محلول ناشناس باید محلول استاندارد تمام ترکیبات مورد نظر را تهیه کرد. باید توجه داشت که تمام نتایج بدست آمده از مقایسه نمونه مجهول با نمونه‌های استاندارد زمانی ارزشمند است که تمامی آنالیزها با یک دستگاه در شرایط آزمایشگاهی یکسان انجام شود.

روش‌های اندازه‌گیری کمی در آنالیز HPLC

در روش‌های اندازه گیری کمی نیز مانند روش کیفی نیاز است محلول استاندارد ماده مورد اندازه گیری موجود باشد. در ابتدا چند محلول با غلظت‌های مشخص از ماده استاندارد ساخته می‌شود و این محلول‌ها وارد دستگاه آنالیز HPLC می‌شوند. شدت و سطح زیر نمودار مربوط به پیک‌ها اندازه‌گیری می‌شود و سپس نموداری بر حسب غلظت و سطح زیر نمودار (در برخی موارد بر حسب شدت) رسم می‌شود. بر حسب یک معادله خطی می‌توان سطح زیر نمودار ترکیب مورد نظر را به غلظت آن ارتباط داد.

در مواردی که ماتریسی که ماده مورد نظر در آن موجود دارد روی نتایج ‌HPLC اثر گذار است، برای اندازه‌گیری کمی ترکیب مورد نظر، مقادیر مشخصی از ماده استاندارد به نمونه اضافه می‌شود و سپس نمودار مساحت زیر نمودار ماده مورد بررسی بر حسب غلظت ماده استاندارد اضافه شده به نمونه رسم می‌شود. بر اساس نمودار بدست آمده و استفاده از یک‌سری روابط ریاضی ساده می‌توان غلظت ماده مورد نظر را در نمونه مجهول مشخص نمود.

مشخصات فنی آنالیز HPLC

• نام دستگاه: Agilent
• نوع آشکارساز: DAD UV-Vis
• مجهز به چندین نوع ستون برای بررسی رنج گسترده‌ای از ترکیبات
• قابلیت اندازه گیری انواع سموم آلفا توکسین در غلظت PPM
• قابلیت شناسایی ترکیبات اوتراتوکسین

مجهز به سیستم‌های:

1. Diod Array and Multiple wavelength detector
2. Micro vaccum degasser
3. Binary pump thermostated column
4. Kobra cell

• کارایی بالا در تشخیص سموم و آفتگش‌ها
• سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی صحیح
• جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما

توانایی ها آنالیز HPLC

• جداسازی و شناسایی ترکیبات آلی در نمونه مجهول
• اندازه گیری سموم مختلف در محیط
• آنالیز مواد غذایی
• آنالیز کمی و کیفی ترکیبات دارویی
• جداسازی و تشخیص پروتیین‌ها و مولکول‌های زیستی
• کنترل استانداردهای داروها، سموم و مواد غذایی
• تشخیص و شناسایی مایعات غیر فرار
• کاربرد برای اسیدهای آمینه، جداسازی، خالص سازی و شناسایی پروتئین‌ها (همچنین تحقیقات پروتومیک)، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربنها، داروها، ترپنوئیدها، حشره‌کش‌ها، آنتی‌بیوتیکها، استروئیدها، گونه‌های آلی و گروهی از مواد گوناگون معدنی و همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها.
• مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف
• تعیین ساختار پلیمرها
• راندمان جداسازی بیشتر نسبت به سایر روشهای کروماتوگرافی

نمونه‌های آنالیز HPLC

قبل از ارسال نمونه برای آنالیز HPLC، متقاضی باید مشخصات نمونه را از طریق ایمیل برای این مرکز ارسال کند تا اپراتور بررسی کند که آیا آنالیز این نمونه امکانپذیر هست یا نه. برای اندازه‌گیری کمی برخی از ترکیبات لازم است نمونه استاندارد آن ترکیب نیز برای اپراتور ارسال شود. بسته به نوع نمونه اپراتور مشخص می‌کند چه مقدار از نمونه باید ارسال شود و یا اگر لازم باشد سوالات بیشتری از طرف اپراتور برای کاربر ارسال می‌شود.