آزمون برادفورد (سنجش کمی پروتئین ها)

آزمون برادفورد (سنجش کمی پروتئین ها)

تست پروتئین برادفورد یا بردفورد bradford  اولین بار توسط ماریون برادفورد در سال ۱۹۷۶ انجام شد.این تست یک روش سریع و دقیق برای اندازه گیری غلظت پروتئین در یک محلول است که با استفاده از طیف سنجی انجام می شود. مبنای این روش رخ دادن یک واکنش است که به ترکیب آمینو اسید پروتئین مورد اندازه گیری وابسته است. اساس آزمایش برادفورد، بر اساس تغییر در جذب رنگ Coomassie Brilliant Blue G-250 است. رنگ Coomassie Brilliant Blue G-250 در سه شکل وجود دارد: آنیونی (آبی)، خنثی (سبز) و کاتیونی (قرمز). در شرایط اسیدی ناشی از اتصال با پروتئین مورد آزمایش، رنگ قرمز به رنگ آبی آن تبدیل می شود. اگر هیچ پروتئینی برای اتصال وجود ندارد، محلول قرمز یا قهوه ای رنگی باقی می ماند. این رنگ تحت تاثیر نیروهای واندروالس یک ترکیب قوی و غیر کملپکس با گروه کربوکسیل پروتئین ها ایجاد می کند و با گروه آمین پروتئین ها برهم کنش الکترواستاتیک تشکیل می دهد. اتصال پروتئین فرم آبی رنگ Coomassie را تثبیت می کند. در نتیجه مقدار کمپلکس  آبی رنگ موجود در محلول نشان دهنده غلظت پروتئین است که می تواند با استفاده از خواص جذب نوری در مقابل پروتئین استاندارد به عنوان شاهد، برآورد شود.

خوانش پروتئین در طول موج ۵۹۵ نانومتر انجام می شود. در حقیقت بر اساس واکنش با اسیدهای آمینه، ماکزیمم شدت جذب رنگ از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر تغییر می کند. مراحل روش در شکل زیر نیز نشان داده شده است. با انجام واکنش و بر اساس غلظت پروتئین رنگ محلول به سمت آبی رنک می رود. سپس مایع را به کوت دستگاه UV-Vis انتقال می دهند. پیش از آزمون باید منحنی کالیراسیون پروتئین را بدست آورده باشید. در این صورت با بدست آوردن عدد جذب می توانید غلظت پروتئین را نیز بدست آورد.

اين تکنیک براي تخمین غلظت پروتئين‌هاي بازي و اسيدي دقت کمتری دارد. همچنین میزان رنگ متصل شده و در نتیجه میزان جذب خوانش شده، وابسته به میزان اسيدهاي آمينه بازي پروتئين است. در نتیجه بايد محتواي اسيد آمينه‌هاي بازي در پروتئين استاندارد، با محتوای پروتئين مورد اندازه گیری يكسان باشد تا تکنیک دقت مناسبی داشته باشد.