ارزیابی سلول های آپوپتوتیک و نکروتیک به روش رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI

ارزیابی سلول های آپوپتوتیک و نکروتیک به روش رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI

آنالیز ارزیابی سلول های آپوپتوتیک و نکروتیک (Apoptosis and Necrosis) روشی جهت بررسی مکانیزم مرگ سلول ها پس از تیمار با انواع مواد و داروها است. در این آنالیز، سلول ها پس از تیمار با مواد ارسالی به دستگاه فلوسایتومتری تزریق شده و از طریق آزمون رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI مکانیزم مرگ مشخص می شود. برای آشنایی با روش مناسب است ابتدا با آپاپتوز و نکروز آشنا شویم. آپوپتوز یا آپاپتوز، فرآیند به شدت تنظیم شده مرگ سلولی است که نه تنها در ریخت زایی تکوینی نقش دارد، بلکه تعداد سلول ها و از بین رفتن سلول های آسیب دیده را کنترل می کند. بنابراین آپوپتوز، نقش مهمی را در سرکوب تومور ایفا می کند.

ممکن است تصور گردد که مرگ سلول‌های انسانی پدیده خوبی نیست. به صورت کلی این فرض مثلا در خصوص سلول هایی که بر اثر جراحت آسیب می بینند صحیح است. با این حال این موضوع اهمیت دارد که برخی اوقات برخی از سلول‌های ما باید از بین بروند! البته نه به صورت تصادفی یا اتفاقی، بلکه در روندی کاملا کنترل شده و هوشمند. به عنوان مثال در دوران جنینی لایه ای بین انگشتان وجود دارد که بعدها بر اثر آپاپتوز خودخواسته از بین می روند. یا زمانی که یک سلول آسیب دیده است مرگ برنامه ریزی شده آنها در واقع باعث نجات بدن می شود. تعادل بین رشد سلول، تمایز و آپوپتوز، تعداد نهایی سلول های بدن را تحت تأثیر قرار می دهد و تنظیم غیرعادی این فرآیندها می تواند باعث رشد تومورها گردد.آپوپتوز، یک مکانیسم اصلی سرکوب تومور در بدن است، زیرا سلول هایی که دارای آسیب دامنه دار در DNA و پتانسیل سرطانی شدن می باشند را از بین می برد. فرآیند آپوپتوز، مرتب، منظم و سازماندهی شده است، که طی آن بقایای اندکی از سلول پیشین بر جای می ماند. توانایی به راه انداختن آپوپتوز در سلول های توموری به عنوان یک طرح راهبردی مهم برای درمان سرطان به شمار می آید. این مسئله توسط این حقیقت که درمان های شیمیایی سنتی موفق، با راه اندازی آپوپتوز عمل می نمایند، حمایت می گردد.

در بدن انسان مکانیزم های مرگ متعددی وجود دارد که دو مکانیزم مرگ آپاپتوز (مرگ برنامه ریزی شده) و نکروز (بافت مردگی) بسیار با اهمیت می باشند. برخلاف آپاپتوز در نکروز سلول ها برنامه ریزی شده از بین نمی روند. به عنوان مثال ممکن است در اثر سموم شیمیایی، سوختگی یا جراحت های فیزیکی متلاشی شوند. پاسخ التهابی سیستم بدن در نکروز نقش اساسی دارد. بر اثر نکروز، ترکیبات داخل وزیکول‌های سلولی به درون سلول ریخته می‌شوند. همچنین غشای سلول آسیب دیده و محتوای داخل سلولی از منافذ غشاء بیرون ریخته می شوند و باعث پاسخ التهابی در  اطراف بافت آسیب دیده می‌شوند. روند آپاپتوز کاملا متفاوت است. پس از ارسال سیگنال و شروع فرآیند، اجزای سلول به بخش های کوچکی تکه تکه می شوند. تشکیل این  تکه ها در شکل زیر نشان داده شده است. 

در سرطان مرگ برنامه ریزی شده نقش بسیار مهمی دارد. زمانی که DNA یک سلول آسیب می بیند، عموما مشکل سلول از طریق خود سلول تشخیص داده می‌شود و  سپس هسته سلول از طریق فرآیندهای ترمیمی، آسیب را ترمیم می کند. ولی اگر قابل ترمیم نباشد، سلول فرمان مرگ خود را صادر کرده و وارد فرایند آپوپتوز می شود. در نتیجه DNA آسیب دیده به دیکر سلول ها و نسل بعدی خود منتقل داده نمی شود. در سرطان با اختلال در فرآیند آپاپتوز جهش های صورت گرفته به نسل بعدی سلول ها منتقل می شود. امروزه طراحی داروها به گونه ای است که منجر به احیای فرآیند آپاپتوز و مرگ برنامه ریزی شده سلول های سرطانی شوند.

جهت ارزیابی سلول های آپوپتوز، تست های متفاوتی وجود دارد که هریک از این تست ها به بررسی ویژگی خاصی از سلول های آپوپتوتیک می پردازد. یکی از اصلی ترین تست ها جهت شناسایی سلول های آپوپتوتیک، استفاده از تکنیک فلوسایتومتری و رنگ آمیزی Annexin V-FITC/PI است. به صورت خلاصه در این روش، سلول های آپوپتوتیک به دلیل فسفاتیدیل سرین سطح سلولی و اتصال به Annexin کونژوگه شده با FITC رنگ آمیزی شده و قابل شمارش می شوند. از طرف دیگر سلول های نکروتیک با رنگ PI رنگ آمیزی می شوند. از اینرو به آسانی درصد سلول های آپوپتوز و نکروز قابل محاسبه می شود.

عدم تقارن لیپیدهای غشای پلاسمایی در سلول‌های زنده به وسیله فلیپازها صورت می‌پذیرد. فلیپازها پروتئین‌های غشایی هستند که باعث انتقال مولکول‌های لیپید از یک لایه به لایه دیگر غشاء می‌گردند. در حالت عادی غشای خارجی دارای اسفنگومیلین و فسفاتیدیل کولین است و غشای درونی دارای فسفاتیدیل اتانول آمین و فسفاتیدیل سرین است که در قسمت سیتوپلاسمی قرار می‌گیرند. به دنبال وقوع آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده و فعال شدن کاسپازها، این توزیع غیرعادی شده و فسفاتیدیل سرین که در حالت عادی در غشای درونی است به غشای خارجی انتقال می‌یابد. روئیت فسفاتیدیل سرین از غشای درونی به غشای خارجی را از مراحل ابتدایی آپوپتوز به حساب می‌آورند. تحقیقات نشان داده است که آنکسین V به‌صورت اختصاصی به فسفاتیدیل سرین در حضور کلسیم اتصال می‌یابد. با استفاده از آنکسین Vنشاندار شده با بیوتین و FTTC، آغاز فرآیند آپوپتوز با بررسی فسفاتتیدیل سرین در غشای خارجی سلول آسان شده است. برای کمی کردن سلول‌های آپوپتوتیک که آنکسین مثبت هستند، از تکنیک فلوسایتومتری استفاده می‌شود که در این تکنیک تک تک سلول‌ها که به‌صورت سوسپانسون درآمده‌اند مورد بررسی قرار می‌گیرند. در سلول‌های سالم آنکسین V نمی‌تواند به سطح خارجی غشاء متصل شود ولی در سلول‌های مرده حتی اگر مرگ برنامه ریزی شده صورت نگرفته باشد، چون تمامیت غشاء از بین رفته است در این حالت آنکسین V به فسفاتیدیل سرین می‌چسبد و باعث می‌شود سلول‌ها انکسین مثبت باشند. برای اینکه خطا در آزمایش رخ ندهد از رنگ پروپیدیوم یدید (PI)همراه با انکسین V استفاده می‌شود که از غشای سلول‌های زنده نمی‌تواند عبور کند. نتیجه حاصل از فلوسایتومتری به‌صورت یک جدول چهارخانه درمی آید که دارای ۴ منطقه است. این مناطق در شکل زیر نشان داده شده است.

• منطقه ۱: ناحیه آنکسین V - / PI – در این ناحیه سلول‌های زنده قرار می‌گیرند.
• منطقه ۲: ناحیه آنکسین V + / PI – در این ناحیه سلول‌های آپوپتوتیک قرار می‌گیرند.
• منطقه ۳: ناحیه آنکسین V + / PI + در این ناحیه سلول‌های مرده چه با مرگ آپوپتوتیک و چه از طریق نکروز قرار می‌گیرند. به این منطقه اصطلاحاً آپوپتوز ثانویه با تاخیری می گویند.
• منطقه ۴: ناحیه آنکسین V - / PI + در این ناحیه سلول‌های نکروز شده قرار دارند (ناحیه سفید رنگ در شکل).