استخراج RNA

استخراج RNA

استخراج RNA همراه با استخراج DNA یکی از تکنیک های پرکاربرد در مطالعات زیست شناسی است. در این تکنیک RNA از سلول استخراج و  خالص سازی می شود. این روش ها برای تشخیص بیماری ها، درمان آنها و یا اهداف مطالعاتی به کار برده می شود. RNA را می توان از سلول ها، انواع مایعات، بافت ها و خون استخراج کرد. نکته حائز اهمیت کیفیت و کمیت  در این فرآیندها است. یکی از چالش های فرآیند استخراج RNA وجود آنزیم ریبونوکلئاز در سلول ها است. این آنزیم می تواند به سرعت RNA را تجزیه کند. باید در نظر گرفت که فرآیند استخراج DNA را نمی توان برای استخراج RNA به کار برد. مشخصات این دو مولکول با هم متفاوت است. همچنین RNA برخلاف DNA تک رشته ای است. در حقیقت RNA حساس تر و ناپایدارتر است. مراحل استخراج RNA بر حسب نوع نمونه مقداری متفاوت است. با این کلیات روش ها نزدیک به هم است. کیفیت محصول نهایی نیز خلوص آن است. DNA یا انواع پروتئین ها برای RNA ناخالصی محسوب می شود. باید از طریق ممانعت کننده ها جلوی فعالیت برخی آنزیم ها و ترکیبات مانند دی ان آی پلیمراز را گرفت. در محصول نهایی خود این ممانعت کننده را نیز نباید حضور داشته باشند. در خصوص ممانعت کننده ها می توان به الکل اتانول و فنل اشاره کرد. در صورت آلوده بودن RNA مطالعات و تکنیک هایی مانند PCR تحت تاثیر شدید قرار می گیرند.

روش های مختلفی برای استخراج RNA به کار برده می شود. مانند تکنیک بر پایه فنل، کلروفورم. تکنیک ستون چرخشی بر پایه غشاء های سیلیکایی و تکنیک های بر پایه کاربرد ذره های مغناطیسی. تکنیک بر پایه تیانسیانات گانیدینیوم فنل، کلروفورم به عنوان یکی از مرسوم ترین روش ها در ادامه شرح داده می شود. اساس این روش استخراج مایع/مایع است. یکی چالش اصلی این روش آلودگی با حلال ها اگر چه کیفیت محصول به صورت کلی با این روش بسیار بالا است. باید ابتدا کلیه وسایل کار را برای خنثی کردن فعالیت Nase با مایع مخصوص حاوی DEPC شست. باید شرایط انجام کار کاملا ایمن انجام شود. قبل از شروع فرآیند باید نمونه را آماده سازی کرد. سلول هایی را که قبلا کشت داده شده اند باید از طریق رسوب دادن به عنوان مثال با سانتریفیوژ جمع گردند. اگر نمونه بافت باشد، مقداری از آن را در نیتروژن مایع همگن می کنند. در مرحله بعد به نمونه ترکیب های لیز کننده را اضافه می کنند. سپس نمونه را داخل انکوباتور قرار می دهند. در مرحله بعد محلول های فنل و کلروفرم به صورت ۱:۱ به سلول ها اضافه می شوند. سپس مخلوط سانتریفیوژ می شود که نتیجه شکل گیری دو فاز آبی و آلی است. چربی های غیر آب دوست و پروتئین ها به فاز آلی و برخی ناخالصی ها و اسیدهای نوکلئیک به فاز آبی می روند. سپس با سمپلر و با نهایت دقت فاز آبی را جدا می کنند. باید میزان pH را به دقت تنظیم کرد. در pH های اسیدی، DNA به فاز آلی می رود و از RNA جدا می شود. تصویری از مراحل استخراج RNA در شکل زیر نشان داده شده است.

مرحله بعد رسوب دادن RNA در محلول آبی است. این کار عموما توسط ایزوپروپانول انجام می شود. محلول حاوی الکل فوق را به صورت سرد به ظرف اضافه می کنند. جهت افزایش ترسیب RNA ظرف را می شود در انکوباتور قرار داد. مرحله نهایی خالص سازی RNA ها است. عموما شست و شو از طریق اضافه کردن اتانول انجام می شود. جهت نگهداری کوتاه مدت محصول استخراج شده نهایی را در فریزر و جهت نگهداری بلند مدت در فریز ۸۰- نگهداری می کنند.