Real Time PCR

آنالیز ریل تایم Real Time PCR ،PCR یکی از دقیق ترین روش ها برای آنالیز بیان ژن می باشد. بدین معنی که آیا تحت شرایط خاصی بیان ژنهای خاصی در سلول دچار افزایش و یا کاهش خواهد شد و یا در نهایت بدون تغییر باقی خواهد ماند. قبل از Real Time PCR معمول ترین روش ها برای تعیین سطح بیان ژن ها عبارتند بودند از: northern blotting، RNase  protection  assays، endpoint  reverse transcription (RT) PCR . RT-PCR نسبت به دو روش دیگر به دلیل راحتی روش و نیاز به RNA کمتر داشتن، بیشتر مورد استفاده قرار می گرفت. با این حال با این روش تنها می شود سطوح بیان ژن ها را در پایان واکنش و با الکتروفورز محصول PCR روی ژل آگارز مشاهده کرد. از این رو RT-PCR می تواند بیشتر برای پی بردن به حضور یا عدم حضور یک ژن خاص مفید باشد. در واقع این تست کیفی یا نیمه کمی می باشد. از اینرو با روش RT-PCR نمی توان به طور کمی به بررسی بیان ژن خاصی پرداخت. به همین دلیل نیاز به یک روش دیگر که کاملا کمی باشد نیاز بود.

در واقع Real Time PCR همان PCR است با این تفاوت که در Real Time PCR با استفاده از مواد فلورسانت تکثیر و افزایش تعداد کپی های RNA در حین انجام واکنش مشخص می شود. بدین صورت که در این روش از موادی استفاده می شود که هر سیکل از واکنش وقتی انجام می شود را نشان می دهد و به این صورت می توان به طور دقیق و کمی به بررسی بیان ژن پرداخت. با توجه به مطالب یاد شده وجود کنترل (به معنی سلول فاقد هرگونه تغییرات اعمال شده) در انجام این تست ضروری می باشد.

مزیت های Real Time PCR:

• اندازه گیری تعداد کپی RNA ژن در مرحله شروع و تعیین کوچکترین اختلاف بین در سطح بیان بین نمونه ها
• مشاهده افزایش تدریجی محصولات PCR در طول آزمایش
• عدم نیاز به الکتروفورز ژل آگارز و حذف احتمال آلودگی در این مرحله

مواد لازم برای انجام تست

۱-کیت استخراج total RNA

۲-کیت ساخت cDNA

۳-کیت Maste Mix Real Time PCR

۴-دستگاه Thermo cycler

مراحل تست REAL Time PCR

• استخراج RNA

اولین مرحله در انجام تست Real time PCR استخراج RNA می باشد که بسته به نوع نمونه متفاوت می باشد. به طور کلی استخراج RNA به دو صورت زیر می تواند انجام پذیرد:

• روش های استخراج آلی با استفاده از معرف ترایزول، معرف کیازول، RNA STAT-60T و روش های مبتنی بر نمک گوانیدیوم
• انواع مختلفی از کیت های جداسازی RNA با فاز جامد که به طور تجاری از شرکت مختلف در دسترس هستند

این نکته حائز اهمیت می باشد که RNA استخراج شده از تمامی نمونه ها باید با یک روش یکسان انجام پذیرد. اگر RNA استخراج شده قرار نیست فوری آزمایش شود باید در فریز -۲۰ به مدت یک ماه و برای مدت زمان بیشتر در فریزر -۸۰ نگهداری شود.

نسبت جذب طول موج ۲۶۰/۲۸۰ RNA استخراج شده می تواند نشان دهند کیفیت استخراج باشد. بدین صورت که اگر این نسبت ۱.۸ باشد نشان دهنده کیفیت خوب استخراج RNA می باشد.

•  انجام Reverse Transcription

جهت انجام Real Time PCR نیاز به ساخت cDNA   از RNA خواهد بود. جهت ساخت آن کیت های مختلفی توسط شرکت ها ساخته شده است که اساس آنها یکسان می باشد. در همگی این کیت ها از آنزیم MMLV که یک آنزیم reverse transcriptase  می باشد استفاده شده است. از دیگر مواد بکار رونده جهت تولید CDNA می توان به رندوم هگزامر و یا Oligo dT اشاره نمود که به عنوان پرایمری برای آنزیم مربوطه عمل می کنند. پس از اضافه نمودن مواد فوق با غلظتی که شرکت سازنده تعیین می نماید، واکنش را درون دستگاه PCR در دما و زمان مشخصی که آن را نیز شرکت سازنده تعیین می نماید قرار می دهیم. جهت انجام واکنش Real Time PCR ذکر این نکته ضروری می باشد که باید RNA تمام نمونه ها به میزان کاملاً یکسانی جهت تهیه cDNA بکار رفته باشد. چرا که این تست باید در مقادیر یکسانی از RNA افزایش بیان mRNA ژن خاصی را نشان دهد.

• کنترل داخلی

در انجام تست Real Time PCR علاوه بر ژنهای مورد نظر جهت تعیین میزان بیان، باید ژن دیگری به عنوان ژن خانه دار هم قرار داده شود. وظیفه ی این ژن نشان دادن صحت ساخت cDNA، میزان خلوص RNA بدست آمده، صحت انجام تست PCR و نیز نرمالایز کردن بیان سایر ژنها می باشد. لذا پیش از انجام هر کاری باید ابتدا برای تمامی ژن ها آزمایش شونده پرایمر طراحی ( و یا از مقالات برداشته شود) و ساخته شود. در هر واکنش PCR وجود این مواد الزامی است: آنزیم DNA پلیمراز (با نام Taq)، بافرmgcl2، dNTP، پرایمر و نهایتاً cDNA.

در اینجا روش انجام یک تست را به عنوان نمونه ذکر می نماییم:

در این تست از دستگاه Thermo Cycler شرکت ABI و کیت Master Mix  همان شرکت بهره گرفته شد. در هر رده ی سلولی مورد آزمایش (هم نمونه ی کنترل و هم نمونه تست) به ازای هر ژن دو نمونه ی تکرار به منظور اطمینان از صحت انجام تست قرار داده شد. میزان Master Mix به ازای هر واکنش ۱۰ میکرولیتر، پرایمر ها ۱میکرولیتر (هم پرایمر Forward و هم پرایمرReverse) و آب ۶ میکرولیتر بوده است. بدین ترتیب عمل شد که ابتدا به ازای هر ژن یک تیوپ حاوی پرایمر، آب، Mester Mix تهیه شد. سپس مقدار ۱۸ میکرولیتر از مخلوط بدست آمده را در لوله های واکنش منتقل نموده و نهایتاً میزان ۲ میکرولیتر از cDNA سنتز شده به هر لوله ی واکنش اضافه شد.

تنظیم دستگاه Thermo Cycler به گونه ای صورت گرفت که ابتدا دما به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۹۵ درجه باقی بماند. این مرحله جهت فعال سازی آنزیم DNA Polymeras ضروری بوده است. سپس ۴۰ سیکل با تغییر دمایی ۱۵ ثانیه در ۹۵ درجه سانتیگراد، ۱ دقیقه در ۶۰ درجه ی سانتیگراد به ازای هر  سیکل به دستگاه اعمال شد.

• کنترل منفی

لازم به ذکر می باشد که در تمامی تست های انجام شونده به ازای هر ژن یک واکنش مازاد که حاوی تمام مواد موجود در واکنش PCR به غیر از cDNA می باشد، انجام خواهد پذیرفت. لزوم انجام این واکنش مازاد بررسی عدم وجود آلودگی در نمونه ها و عدم وجود واکنش هایی نظیر پرایمر دایمر در تست می باشد.

منابع خطا:

۱-عدم استخراج صحیح RNA

۲-عدم خلوص کافی RNA

۳-عدم ساخت cDNA

۴-خطا در اضافه کردن مواد PCR

۵-کالیبره نبودن دستگاه PCR

۶-آلودگی در انجام هر مرحله از کار

۷-عدم طراحی پرایمر های مناسب و اختصاصی

۸-وجود آلودگی DNA سلولی

آنالیزهای کمی در Real time PCR

دو روش عمده برای بررسی کمی در  Real time PCR وجود دارد:

• روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق):

در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (nm260) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌شود. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقعت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرارمی دهیم  با استفاده از Ct که دستگاه برای هر رقت به ما می دهد یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست امده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار غلظت یا تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.

• روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی):

برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن بتا اکتین و GAPDH استفاده می‌شود. به این ژن‌ها Housekeeping گویند. بیان این ژن ها ثابت است که با مقایسه نمونه تیمار شده با شاهد و کنترل داخلی می توان کاهش یا افزایش بیان را مشاهده کرد.

• تشخیص پلی مرفیسم توسط Real time PCR

استفاده از این تکنیک اجازه تعیین کمیت نواحی چند شکلی DNA و یا تعیین ژنوتیپ پلی مرفیسم یک  نقطه ای SNPS) Single nucleotide polymorphism,) جدید را به ما می دهد. مانیتور کردن همزمان پروسه تکثیر و تعیین ژنوتیپ با استفاده از هیبریداسیون پروبها و با آنالیز منحنی ذوب امکان پذیر می شود. موتاسیون نقطه ای بوسیله آنالیز منحنی ذوب تشخیص داده

می شود. دمای بحرانی Tm که در آن DNA تک رشته ای می شود یک شناساگر برای وجود یا عدم وجود موتاسیون می باشد.

پروب اختصاصی برای ناحیه موتانت تهیه می شود در دمای پایین پروب به ناحیه های غیر اختصاصی متصل می گردد و با افزایش دما پروب اختصاصی تر عمل می کند، منحنی ذوب حاصل از این واکنش را آنالیز می کنیم تا متوجه وجود یا عدم وجود موتاسیون شویم.