سنتز cDNA

سنتز cDNA

جهت مطالعه مقدار بیان ژن ها، در گام اول نیاز است تا RNA ها از سلول ها استخراج شوند و سپس از طریق آنزیم رونوشت بردار معکوس یا Reverse Transcriptase مولکول cDNA یا DNA مکمل ساخته شوند. آنزیم رو نوشت بردار معکوس آنزیمی است که می تواند از روی RNA مولکول های DNA را سنتز کند. مولکول cDNA رشته ای از مولکول DNA است که از روی mRNA بالغ بدست می آید. پس از سنتز cDNA امکان آنالیز کمی از مقدار بیان ژن مورد نظر از طریق Real-Time PCR وجود دارد. در تولید مولکول cDNA می توان از پرایمرهای مختلفی استفاده کرد: oligo-dt، پرایمرهای تخصصی و هگزامرهای رندوم.

پرایمر oligo-dt به منظور تولید DNA مکمل از روی mRNA به کار می رود. oligo-dt با انتهای رشته های mRNA با توجه به اینکه از تیمین غنی هستند، مکمل است و به بخش انتهایی آن متصل می گردد. هگزامرهای رندوم می توانند در سنتز DNA مکمل از دیگر RNA های استخراج شده به کار برده شوند. در حقیقت اتصال آنها به بخش های مختلف RNA تصادفی است. زمانی که می خواهیم از RNA هایی مانند microRNA استفاده کنیم، پرایمرهای تخصصی مورد استفاده قرار می گیرند. مراحل سنتز cDNA در شکل زیر نشان داده شده است.

مراحل سنتز  cDNA به این صورت است که ابتدا نمونه های حاوی RNA به داخل تیوب برده می شوند. در حلال آبی که RNA حل می شود نباید RNAase وجود داشته باشد. سپس به تیوب ها پرایمرها اضافه می شوند. در مرحله بعد باید نمونه ها در دستگاه های سیکل حرارتی و به مدت پنج دقیقه در دمای ۶۵ درجه سانتی گراد قرار گیرند. در این مرحله رشته های RNA از هم به صورت کامل باز می شوند. سپس نمونه ها را برای زمان کوتاهی بر روی یخ قرار می دهند. به هر تیوب باید مقداری مشخص از  مسترمیکس اضافه شود و در نهایت نمونه ها تحت سیکل حرارتی قرار می گیرند. در سیکل اول و در دمای پنجاه و پنج درجه پرایمرها و سپس آنزیم ها متصل می شوند و  فرآیند سنتز انجام می شود. در سیکل دوم و در دمای هشتاد و  پنج درجه سانتی گراد آنزیم ها غیرفعال می شوند و در سیکل سوم نمونه ها سرد می شوند. سپس جهت نگه داری نمونه ها را به دمای ۲۰- درجه منتقل می کنند.