تشخیص و بررسی کیفیت زعفران با استفاده از آنالیز کروماتوگرافی

زعفران گیاهی بسیار پرکاربرد در تغذیه و طب ایرانی است. در نتیجه بررسی کیفیت و اصالت آن بسیار با اهمیت است. پودر گلرنگ، پودر زردچوبه، آلورا قرمز و تارترازین از رایج ترین افزودنی ها به زعفران است. زعفران یک پودر قهوه ای مایل به قرمز یا زرد طلایی است که در آب رنگ آن بصورت زرد کمرنگ در می آید. دلیل رنگ آن حضور دو ترکیب کروسین (Crocin) و کروستین (crocetin) است. دقیق ترین روش برای تعیین خلوص استفاده از روش های کروماتوگرافی مانند GC/MS ،HPLC و کروماتوگرافی لایه نازک است. در این مقاله کاربرد هر کدام از این روش ها و مزایا و معایب آنها معرفی می شود. همچنین شما با سایر روش های تشخیص ناخالصی های زعفران آشنا خواهید شد.

زعفران ادویه ای است که از گل Crocus sativus به دست می آید. زعفران گیاهی است چند صد ساله و پاییزی که در طبیعت رشد می کند. که در ابتدا از شرق مدیترانه همراه با گل های پاییزی روییده است و به زعفران وحشی نیز معروف است و منشأ آن آسیای مرکزی است. رنگ زعفران معمولا به رنگ زرد کمرنگ و نارنجی روشن می باشد. زعفران دارای طعم نسبتا خنثی با مقدار کمی تلخی است که دلیل آن وجود نوعی ماده به نام پیکروکروسین (Picrocrocin ) با فرمول شیمیایی C₆H₂₆O₇ می باشد.

رنگ زعفران

زعفران یک پودر قهوه ای مایل به قرمز یا زرد طلایی است که در آب رنگ آن بصورت زرد کمرنگ در می آید. کروسین (Crocin) و کروستین (crocetin) دو ماده تعیین کننده در رنگ زعفران هستند. این دو ماده جامد با غلظت مجموع ۴ تا ۶ درصد در زعفران وجود دارند.

• کروسین (Crocin) : کروسین یک گلیکوزید زرد-نارنجی است که در آب داغ محلول است و در الکل، گلیسیرین و پروپیلن گلیکول به ندرت محلول است و در دمای ۱۸۶ درجه سانتی گراد ذوب می شود.
• کروستین (crocetin) : کروستین یک اسید دی کربوکسیلیک است که در آب و اکثر حلال های آلی کم محلول است، اما در پیریدین و بازهای آلی مشابه به آن و همچنین در هیدروکسید سدیم رقیق محلول است. کروستین در دمای ۲۸۵ درجه سانتی گراد ذوب می شوند.

کروسین و کروستین مواد تعیین کننده رنگ زعفران

کاربرد کروماتو گرافی در تشخیص زعفران اصل

کروماتوگرافی یکی از رایج ترین و متداول ترین روش برای تشخیص کمی و کیفی ناخالصی ناشی از رنگ های محلول در آب و اسید استفاده می شود. از آنجایی که عموما زعفران با افزودن ناخالصی مانند رنگ های مصنوعی همراه است، روش های کروماتوگرافی به راحتی می توانند آن ها را شناسایی کنند.

رایج ترین روش های کروماتوگرافی مورد استفاده برای ارزیابی و شناسایی ناخالصی ها در زعفران عبارتند از :

• کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
• کروماتو گرافی گازی (GC)
• کروماتو گرافی لایه نازک (TLC)

محققان اغلب مواقع روش های مختلف کروماتوگرافی را با سایر تکنیک ها و آشکارسازها  برای ایجاد تکنیک های دقیق تر و حساس تر ترکیب کنند. مانند :

• کروماتو گرافی لایه نازک (HPTLC) : کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا که پیشرفته ترین شکل TLC می باشد و به این ترتیب شرایط برای جداسازی مواد با حساسیت، دقت و کارایی بالاتری نسبت به TLC ارائه می دهد.
• کروماتوگرافی مایع– طیف‌سنجی (LC-MS/MS) : ﯾﮑﻰ از روش ﻫﺎى آﻧﺎﻟﯿز نمونه های دارویی، غذایی، بیولوژیکی و بیوشیمیایی اﺳﺖ ﮐﻪ بخاطر قدرت و کارایی بالایی که دارد مورد استفاده قرار می گیرد. امکان شناسایی و تعیین مقدار ناخالصی نمونه ‌هایی که از طریق سایر روش ها امکان پذیر نیست با این روش انجام می شود.
• کروماتو گرافی مایع (HPLC/PDA/MS) : دتکتور(آشکارساز) PDA دستگاه HPLC امکان تشخیص در کل طیف را به صورت همزمان فراهم می آورد یعنی نتایج را بر اساس سه بعد زمان و شدت نور و طول موج و  تعیین می کنند.
• کروماتو گرافی گازی- طیف سنج جرمی (GC/MS/MS) : این روش برای شناسایی موادشیمیایی فرار استفاده می شود. هم چنین این روشاطلاعاتی درباره ایزوتوپ مواد نیز ارایه می کند.
• کروماتو گرافی گازی- آشکارساز یونیزاسیون شعله (HS-GC-FID) : روش کروماتو گرافی گازی با آشکارساز یونیزاسیون شعله حساسیت بالایی نسبت به ترکیبات آلی داشته و محدوده خطی وسیعی دارد.

 کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک تکنیک ارزشمند برای تجزیه و تحلیل اجزای غیر فرار موجود در زعفران است.

در روش HPLC نمونه مورد نظر در یک حلال غیر قطبی (فاز متحرک) حل می شود مانند: کلروفرم، سیکلوهگزان و غیره، قرار داده می شود و سپس از طریق یک ستون نازک که پر از حلال قطبی مانند متانول یا استونیتریل که به عنوان فاز ساکن شناخته می شود عبور می کند. اما در مورد نمونه های غذا به منظور تسریع در تجزیه و تحلیل، فاز معکوس HPLC معمولا استفاده می شود یعنی فاز متحرک معمولاً قطبی است در حالی که فاز ثابت غیر قطبی نگه داشته می شود. معمولاً عملیات کروماتوگرافی بر اساس جداسازی اجزای مخلوط با استفاده از سرعت های مختلف انجام می شود. در روش‌های کروماتوگرافی مایع، تمایز مواد بر اساس قطبیت،  بار الکتریکی یا اندازه مولکولی اجزا است. تکنیک HPLC پرکاربردترین روش کروماتوگرافی در میان روش های تحلیلی تشخیص تقلب و ناخالصی و مشخص کردن زعفران اصل به شمار می آید. مهمترین آشکارسازهای مورد استفاده در HPLC شامل UV–vis و  PDA و RI است.

درسال های اخیر پیشرفت چشمگیری در روش های تشخیص زعفران اصل با استفاده از کروماتوگرافی صورت گرفته است به طوری که وجود ناخالصی با کمترین میزان را نیز می توان شناسایی کرد. جداسازی اجزای فرار( کروماتوگرافی گازی) نوع دیگری از کروماتوگرافی بوده که بسیار سودمند است. کروماتوگرافی گازی (GC)  معمولاً همراه با MS به کار می رود، برای بهبود دقت و حساسیت تشخیص زعفران اصل از آشکارسازهای طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR) استفاده می شود. جداسازی در GC بر اساس نوسانات و میل ترکیبی اجزا و هم چنین بر اساس فشار بخار ترکیبات موجود انجام می شود.  در این روش فاز متحرک یک گاز بی اثر مانند نیتروژن یا هیدروژن است در حالی که فاز ساکن ممکن است یک جامد یا یک مایع چسبناک متصل به یک بستر جامد باشد. از این رو بسته به فاز ثابت، دو روش استفاده می شود :

کروماتوگرافی گاز- جامد (GSC) و کروماتوگرافی گاز - مایع (GLC)

برای شناسایی منشأ تقلب و ناخالصی در زعفران و تشخیص کروسین، کروستین و سافرانال مصنوعی، کروماتوگرافی گازی بسیار موثرتر از HPLC است. چند مواد ناخالص مهم از جمله پودر گلرنگ، پودر زردچوبه، آلورا قرمز و تارترازین با استفاده از لایه نازک تعیین شده اند. مطالعات انجام شده نشان می دهد کمترین درجه تشخیص ناخالصی در زعفران برای آلورا قرمز 2.59 درصد، تارترازین 4.15 درصد، گلرنگ 31.01 درصد و زردچوبه  41.98 درصد بوده است. ناخالصی های گلرنگ و زرد چوبه توسط روش GC-MS / HSSPME  شناسایی شده اند. در این بررسی، کمترین درجه تشخیص ناخالصی برای گلرنگ و گل همیشه بهار به ترتیب 3 و 2 درصد شناسایی شده اند.

مزایا و معایب استفاده از دو روش کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

مزایا کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا (HPLC):

• توانایی تشخیص ترکیبات فرار و غیر فرار،
• توانایی شناسایی ترکیبات کمتر پایدار در مقایسه با GC به دلیل گرم نشدن نمونه ها و ستونها.

مزایا کروماتوگرافی گازی (GC) : 

• وضوح بهتر با جداسازی  واضح تر نسبت به روش کروماتو گرافی مایع (HPLC)
• مناسب برای تشخیص مواد تقلبی بسیار فرار موجود در زعفران مانند سافرانال مصنوعی
• هم چنین تشخیص اصالت زعفران بر اساس منشاء جغرافیایی ( محل رویش گیاه زعفران)  بهتر از سایر روش های کروماتوگرافی است.

 معایب کروماتو گرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) :   

• فرآیند زمان بر می باشد به دلیل تعداد زیاد نمونه های آماده سازی
• طولانی بودن مراحل تجزیه و تحلیل نمونه
• وضوح کمتر در مقایسه با روش کروماتو گرافی (GC)

معایب کروماتوگرافی گازی (GC) : 

• برای شناسایی ترکیبات غیر فرار موجود در زعفران نامناسب است. 
• هزینه بالای تجزیه و تحلیل نمونه ها در مقایسه با سایر روش های کروماتوگرافی ذکر شده.
• نیاز به شخص متخصص و آموزش دیده دارد.

سایر روش های تشخیص ناخالصی زعفران و شناسایی زعفران اصل

• روش های فیزیکی : یکی از ابتدایی ترین و ساده ترین روش ها برای ارائه اصولی اطلاعات در مورد خلوص زعفران روش های فیزیکی است. از تکنیک هایی مانند مورفولوژی، طعم، رنگ سنجی و همچنین خصوصیاتی مثل رطوبت و خاکستر می توان استفاده کرد. کاربرد ابزارهای میکروسکوپی در تعیین ناخالصی های موجود در زعفران نیز یکی از روش های فیزیکی است. غوطه ور کردن رشته های زعفران در آب نمونه ای از یک روش فیزیکی است. در این روش ساده زعفران اصل به آرامی در آب به رنگ نارنجی کمرنگ یا زرد درمی آید. ولی زعفران تقلبی یا رنگی آزاد نمی کند یا فورا رنگ می دهد.  
• روش ها و تکنیک های شیمیایی و بیوشیمیایی : تکنیک های مختلف شیمیایی و بیوشیمیایی برای تشخیص زعفران اصل از نوع ناخالص ارائه شده است از جمله آنها بر اساس کروماتوگرافی، طیف سنجی است.  علیرغم اینکه  تحلیل و برسی  این روش ها دقیق تر، حساس تر و خاص تر هستند نسبت به روش های فیزیکی، تجزیه و تحلیل نمونه گران هستند و نیاز به متخصص آمورش دیده دارد.
• تکنیک های طیف سنجی : طیف سنجی مطالعه داده های طیفی تولید شده توسط برهم کنش تابش الکترومغناطیسی با نمونه است که سه شکل از فعل و انفعالات ناشی از تابش امواج الکترومغناطیسی را د ربر می گیرد که عبارتند از: جذب، انتقال، و طیف سنجی پراکندگی.
• تکنیک های مبتنی بر مولکول و DNA : به دلیل پایداری پروفایل های ژنتیکی (DNA) در گیاه و گونه های جانوری از تولد تا مرگ، تکنیک های مولکولی برای تشخیص تقلب های بیولوژیکی مناسب هستند.
• تکنیک های حسگر غذا : حسگر در اصل نوعی مبدل انرژی است که می تواند برخی تغییرات فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی و پارامترهایی مانند دما، رطوبت نسبی و pH را اندازه گیری کند. پس از تشخیص تغییرات، سنسورها  نتیجه را به عنوان یک سیگنال خروجی مربوط به تغییرات ارسال می کنند. انواع مختلفی از حسگرها در بازار موجود است مانند حسگر نوری، حسگرهای مبتنی بر پلیمر، حسگرهای گازی، الکتروشیمیایی و حسگرهای رنگی و مبدل های الکتریکی برای کاربردهای غذایی ایده آل هستند زیرا آنها سریع، ارزان هستند و ممکن است در غذا ادغام شوند. در واقع، سنسورها ابزارهای قدرتمندی هستند که به طور قابل توجهی خاص تر از سیستم های تشخیص مانند کروماتوگرافی و طیف سنجی هستند. این تکنیک ها می توانند انواع تقلب و ناخالصی موجود در مواد غذایی را شناسایی کنند و با حداقل غلظت نمونه می توانند به سرعت ناخالصی ها را مشخص کنند.