روش های شناسایی مواد موثره داروهای گیاهی با کروماتوگرافی و طیف سنجی

امروزه گیاهان دارویی مورد توجه بسیاری از محققین و حتی عموم مردم قرار گرفته است. عمده خواص دارویی این گیاهان به دلیل خواص ماده موثره آنها است. در نتیجه مطالعه، جداسازی و شناسایی این ترکیبات نقش مهمی در توسعه گیاهان دارویی دارد. روش های آنالیز متعددی برای این منظور مورد استفاده قرار می گیرند. در این مقاله به سه روش آنالیزی پرکاربرد در این حوزه، کروماتوگرافی مایع و گازی، طیف سنجی جرمی و طیف سنجی مرئی - ماورای بنفش (UV/VIS) پرداخته می شود. همچنین کاربرد این روش ها در حوزه شناسایی ماده موثره گیاهان دارویی بحث شده است.

ایران از جمله مناطقی در جهان به شمار می­ رود که دارای تنوع آب و هوایی بسیار زیادی است. این امر باعث شده است که انواع مختلفی از گیاهان دارویی در آن رشد کنند. استفاده از گیاهان دارویى در کشورهاى توسعه یافته در حال گسترش است. کارایى و اثر درمانى گیاهان از مواد موثره آن­ها مشتق شده است. در تعیین مقدار ماده موثره، روش هاى کروماتوگرافى و اسپکتروسکوپى نقش مهمى در کنترل کیفیت فرآورده ­هاى گیاهى دارند. آلودگی ­هایى مانند میکروارگانیسم ها، فلزات سنگین، مایکوتوکسین­ها مى­توانند در کیفیت، ایمنى و کارایى فراورده­هاى گیاهى تاثیر گذار باشند. با توجه به اهمیت کنترل کیفی گیاهان دارویى و فرآورده­هاي گیاهى، روش­هاى مختلفی برای استاندارسازی از جنبه هاى فیزیکى، شیمیایى، بیولوژیکى و زیستى وجود دارد. هدف این مقاله ارائه شرحی راجع به گیاهان دارویی، مواد موثره و روش های شناسایی آن­ها است.

گیاهان دارویی

گیاهان دارویی گیاهانی هستند که همه یا بخشی از قسمت های مختلف آن دارای ترکیبات موثره و خواص درمانی است. این ترکیبات موثره باعث وجود ویژگی های منحصر به فرد در گیاهان دارویی می­ شود. گیاهان دارویی را پس از فرآوری نمودن استفاده می­ کنند. فراوری های انجام گرفته، خشک کردن، عصاره­ گیری، استخراج روغن فرار و عرق گیری می باشند. از ترکیبات موثره گیاهان دارویی می­توان آلکالوئیدها، گلیکوزیدها، روغن های فرار، فلاون ها، فلاونوئیدها، موسیلاژها، تانن ها و .. را نام برد.

آنالیز ترکیبات موثره گیاهان دارویی

با توجه به اهمیت ترکیبات موثره در گیاهان، نیاز است که این ترکیبات به درستی شناسایی شوند و غلظت آن­ها در هر گیاهی مشخص شود. از این رو روش های مختلفی برای شناسایی این ترکیبات وجود دارد. از این روش­ها می­توان به طیف سنجی جرمی، کروماتوگرافی گازی با طیف سنج جرمی (GC-MS)، دستگاه کروماتوگرافی گازی(GC)، دستگاه کروماتوگرافی مایع- آشکار ساز (HPLC-UV/Vis) و دستگاه اسپکتروفتومتر (UV/VIS) اشاره کرد. روش های جداسازی و خالص سازی ترکیبات طبیعی با استفاده از تکنیک های کروماتوگرافی صورت می­گیرد و روش‌های اسپکتروسکوپی در تعیین ساختار ترکیبات خالص سازی شده استفاده می­ شوند. گاهی هم هر دو روش در یک دستگاه مورد استفاده قرار می­ گیرند. در ادامه به توضیح این روش ها پرداخته می­ شود.

کروماتوگرافی گیاهان دارویی

از مهم ترین روش های جداسازی ترکیبات مختلف موجود در گیاهان دارویی، روش کروماتوگرافی است. کروماتوگرافی شامل گروهی از روش­های پرکاربرد و مهم فیزیکی است که اجزای نزدیک به هم یک مخلوط پیچیده را از یکدیگر جدا می­ کنند. در حقیقت کروماتوگرافی یک فرایندی است که در آن اجزای نمونه مخلوط بین دو فاز موجود در کروماتوگرافی جدا می شود. یک فاز ساکن است و فاز دیگر در درون بستر کروماتوگرافی حرکت می­ کند. فاز ساکن یک ماده جامد متخلخل فعال است در محلی داخل ستون قرار گرفته است. فاز متحر می تواند یک گاز، یک مایع یا یک سیال ابر بحرانی باشد. فاز متحرک از درون فاز ساکن با فشار عبور می­کند. دو فاز طوری گزینش می­شوند که اجزای نمونه  با درجات مختلفی بین فاز ساکن و متحرک توزیع شوند.

اساس جداسازی در کروماتوگرافی می­تواند جداسازی براساس وزن مولکولی و جداسازی بر اساس میل اتصال به فاز ثابت باشد. اجزایی که با فاز ساکن نگه داشته می­شوند فقط به آهستگی با جریان فاز متحرک حرکت می­کنند. اجزایی که به طور ضعیف به وسیله فاز ساکن نگه داشته می­شوند، به سرعت حرکت می­ کنند. این اختلاف درحرکت، باعث می­شود اجزای نمونه به لایه های نازک مجزا تفکیک شوند که می­توان از آنها درتحلیل کیفی و کمی استفاده کرد. از مهم ترین روش هایی که در جداسازی ترکیبات موثره استفاده می­شود، کروماتوگرافی گازی و ستونی با عملکرد بالا می­باشد.

شکل ۱- انواع روش های کروماتوگرافی.

کروماتوگرافی ستونی با عملکرد بالا

از انواع کروماتوگرافی که برای جداسازی و شناسایی ترکیبات موثره می­ باشد، ستون کروماتوگرافی با عملکرد بالا است که به ستون‌های HPLC معروف هستند، در آن­ها از یک فاز متحرک مایع استفاده می‌شود. در ستون‌های مایع، هر چه قطر مواد پرکننده ستون، کاهش یابد، بازده افزایش پیدا می‌کند. ترکیبات مختلف گیاهی توسط فاز مایع نسبت به هم جدا می­شوند و در مکان های مختلف قرار می­گیرند.

کروماتوگرافی گازی (GS) گیاهان دارویی

از دیگر روش های کروماتوگرافی به کروماتوگرافی گازی GS اشاره می­شود. در کروماتوگرافی گازی نمونه تبخیر وسپس به سر ستون کروماتوگرافی تزریق می­شود. عمل شست­ و شو با جریانی از فاز متحرک گازی بی­اثر مانند هلیوم، نیتروژن، آرگون و دی‌اکسید کربن انجام می­گیرد. فاز متحرک با مولکول­های ترکیبات گیاهی برهم­کنش نداشته و صرفا به عنوان عاملی برای گذار مولکول­ها از داخل ستون عمل می­کند و تنها فاز ساکن توانایی اثر­گذاری بر مولکول­های نمونه را دارد. در ستون جداسازی بر اساس حل‌شوندگی اجزا در فاز ساکن اتفاق می‌افتد.

فشار بخار بالاتر یک جزء نشان‌دهنده حل شدن بیشتر آن در فاز متحرک است. این اجزاء سریع‌تر حرکت می‌کند. بر این اساس ، اجزای مختلف ترکیبات گیاهی در زمان‌های مختلفی از ستون خارج می شوند و به آشکارساز می‌رسند. پس از آن، سیگنال‌های تقویت شده و خروجی کمّی حاصل از فرایند جداسازی اجزا گزارش می‌شود.

شکل ۲- تصویر شماتیک از کروماتوگرافی گازی.

طیف سنج جرمی گیاهان دارویی

طیف سنجی جرمی (MS)، روشی تحلیلی برای شناسایی ماهیت عنصری یا ایزوتوپی یک نمونه، جرم ذرات، مولکول‌ها و بیان ساختار آن‌ها و سایر ترکیبات شیمیایی می باشد که اساس کار آن اندازه‌گیری نسبت جرم به بار در یون‌ها می­ باشد. با این روش می­ توان به ماهیت و ترکیبات موجود در نمونه عصاره گیاهان پی برد. نتایج طیف سنجی جرمی به طور معمول به صورت یک طیف جرمی نشان داده می‌شوند. طیف سنجی جرمی کاربردهای گسترده ای هم در مخلوط­ها و هم در نمونه‌های خالص دارد. طیف جرمی نموداری از شدت سیگنال یون برحسب تابعی از نسبت جرم به بار می باشد.

شکل ۴-  اجزای دستگاه طیف سنج جرمی

از جمله اطلاعاتی که می­توان از طیف سنج جرمی برای آنالیز گیاهان دارویی بدست آورد موارد زیر قابل اشاره هستند.

• شناسایی ترکیبات خالص آلی در ترکیبات موثره 
• تشخیص نوع گروه های عاملی در ترکیبات آلی 
• تعیین فرمول شیمیایی ترکیب 
• تعیین وزن مولکولی ترکیبات موثره
• تعیین غلظت ترکیبات

دستگاه اسپکتروفتومتر (UV/VIS)  

دستگاهی است که به منظور شناسایی عناصر موجود در نمونه ها مورد استفاده قرار می گیرد. نحوه کار به این صورت است که نور با طول موج مشخص به نمونه برخورد کرده و میزان جذب نور توسط آشکار ساز ثبت می­شود. براساس قانون بیرلمبرت میزان غلظت عنصر شناسایی می­شود. این روش از روش های مهم جهت تعیین عناصر موجود در ترکیبات موثره گیاهی است.

روش های تلفیقی آنالیز مواد موثره داروهای گیاهی

از روش های تلفیقی می­توان به کروماتوگرافی گازی با طیف سنج جرمی (GC-MS) و دستگاه کروماتوگرافی مایع- آشکار ساز (HPLC-UV/Vis) اشاره کرد. این روش ها با ترکیب دو روش آنالیز، شناسایی را انجام می­ دهند. طرز عملکرد این روش ها از طرز کار اجزای آن پیروی می­ کند. در واقع این روش ها هم جداسازی و هم آنالیز عنصری و ترکیبات را با هم انجام می ­دهند که بهترین روش برای شناسایی ترکیبات مختلف در گیاهان دارویی می­ باشند.