کروماتوگرافی چیست و دسته بندی انواع کرماتوگرافی بر اساس نوع آشکارساز چگونه است؟

در تجزیه و تحلیل (آنالیز) شیمیایی، کروماتوگرافی یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی یک مخلوط به اجزای سازنده آن است. به این صورت که آنالیت (مخلوطی که قرار است  شناسایی شود) در یک حلال فاز سیال (گاز یا مایع) به نام فاز متحرک حل می شود که آن را از طریق سیستمی (ستون و صفحه یا ورق) که ماده ای به نام فاز ساکن روی آن ثابت می شود، حل می شود. منظور از فاز متحرک، فازی است که نمونه را در طول فرایند جداسازی با خود حمل می کند). منظور از فاز ساکن، فازی است که دارای پیوند کوالانسی بوده و به دیواره ستون کروماتوگرافی متصل می شود. از آنجایی که اجزای مختلف مخلوط تمایل متفاوتی برای حرکت در فاز سیال و در تماس با فاز ساکن دارند اجزای تشکیل‌دهنده با سرعت‌های ظاهری متفاوتی در فاز سیال متحرک حرکت می‌کنند و این پدیده  باعث جدا شدن اجزا سازنده مخلوط می‌شوند.

نحوه انجام کروماتو گرافی 

حرکت مولکولی جنبشی به طور پیوسته اجزا سازنده را بین دو فاز مبادله می کند. برای یک گونه معین، نسبت زمان سپری شده در مناطق متحرک و ساکن برابر است با نسبت غلظت آن در این مناطق، که به عنوان ضریب تقسیم شناخته می شود. مخلوطی از اجزا سازنده در یک منطقه محدود یا منطقه باریک وارد سیستم می‌شوند و گونه‌های مختلف با سرعت‌های متفاوتی در جهت جریان سیال منتقل می‌شوند. در شکل زیر فاز ساکن (stationary) و فاز متحرک (mobile phase) مشاهده می شود. مولکول های حل شونده نمونه از طریق فاز متحرک و بین بخش های فاز ساکن حرکت می کند.

شکل ۱: نمای شماتیک از حرکت مولکول های نمونه در فاز سیال در یک روش کروماتوگرافی.

انواع روش های کروماتوگرافی 

براساس معیارهای مختلف، روش های کروماتوگرافی تقسیم بندی می شوند. این معیارها شامل حالت فیزیکی فاز متحرک، چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن و مکانیسم جداسازی می باشند.

تقسیم بندی از منظر حالت فیزیکی فاز متحرک

• کروماتوگرافی گازی(GC): کروماتوگرافی گازی مرسوم ترین روش‌ کروماتوگرافی است که برای آنالیز نمونه‌هایی استفاده می شود که قابلیت تبخیر شدن بدون ایجاد تغییر در ساختار یا از بین رفتن آن را دارند. تعیین خلوص یک نمونه، جداسازی ترکیبات نمونه مورد آنالیز، تعیین مقدار هر یک از ترکیبات موجود در یک نمونه و نیز خالص‌سازی آنها به ویژه در صنعت داروسازی، از کاربردهای مرسوم این روش می باشد.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی گازی(GC):

1. منبع تامین‌کننده فاز متحرک(گاز حامل): گاز حامل  انتخابی باید از نظر شیمیایی خنثی باشد که با آنالیت موجود واکنش ندهد، لذا گازهای مورد استفاده عبارتند از : کربن دی‌اکسید، هیدروژن، نیتروژن، آرگون و هلیوم.
2. سیستم تزریق نمونه: برای جلوگیری از خارج شدن گاز حامل و نمونه و هم چنین جلوگیری از تغییر فشار گاز محفظه های تزریق تعبیه شده اند.
3. ستون: مهم‌ترین عضو سیستم بوده زیرا مراحل تفکیک و جداسازی ترکیبات نمونه در آن اتفاق می افتد.
4. آون: مسئولیت تنظیم دما ستون در حین اجرای فرایند را دارد. دما در آون دارای یک مقدار ماکزیمم و مینیمم است.
5. آشکارساز: نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از ترکیب نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید می‌ شود که بسته به نوع نمونه، نوع آشکارساز و به دنبال آن نوع گاز حامل انتخابی تغییر می کند.

آنالیز GC-MS

 شکل ۲: اجزاء دستگاه کروماتوگرافی گازی.

• کروماتوگرافی مایع( HPLC) : یکی از روش های مهم که برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر بسیار کم از مواد گوناگون مورد استفاده قرار می گیرد. دلایل اهمیت این روش عبارت است از حساسیت روش، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌ گیری‌ های کمی صحیح، دقت کافی برای جداسازی ترکیبات نمونه ‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و حرارت که با روش کروماتوگرافی گازی امکان پذیر نیست.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی مایع( HPLC) :

1. مخزن حلال: حلال باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده می‌شوند.
2. پمپ: استفاده از پمپ‌ به دلیل عبور فاز متحرک و نمونه از میان فاز ساکن با سرعت نسبتا بالا و جریان ثابت می‌باشد.
3. سیستم تزریق: فشار عملیاتی دستگاه کروماتوگرافی مایع به اندازه ای بالا است که نمی‌توان مانند کروماتوگرافی گازی تزریق را به صورت مستقیم انجام داد لذا تزریق نمونه در یک لوله حلقه مانند به نام Loop صورت می‌گیرد.
4. ستون: روند جداسازی ترکیبات بر اساس میزان برهم کنش آنها با فاز ساکن که بر پایه قطبیت ترکیبات انجام می‌شود، در ستون جداسازی می‌شوند.
5. آشکارساز: نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز می شود و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید می‌کند.

شکل ۳: تصویر اجزاء دستگاه کروماتوگرافی مایع.

آنالیز HPLC

تقسیم بندی از منظر چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن

• کروماتوگرافی ستونی : در این روش فاز ساکن در داخل یک لوله باریک به نام ستون ثابت و محکم شده است. سپس فاز متحرک از درون ستون به کمک نیروی گرانش یا یک نیروی خارجی حاصل از پمپ عبور می‌کند و اجزای مخلوط می‌توانند با سرعت‌های مختلفی به پایین ستون حرکت کنند.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی ستونی 

۱) جاذب های مناسب: تعدادی از جاذب های مرسوم که معمولا در داخل ستون کروماتوگرافی ستونی استفاده می شوند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، کربنات کلسیم واکسید منیزیم.

۲) حلال ها یا مخلوط های حلال: ذرات مخلوط بایستی در حلال حل شوند، هگزان، تترا کلرید کربن، تولوئن، بنزن، دی کلرو متان، کلرو فرم، دی اتیل اتر، اتیل استات حلال هایی با توانایی بالا در انتقال ذرات نمونه به پایین ستون هستند.

۳) مولکول های نمونه یا آنالیت: اندازه ذرات نمونه باید يكنواخت بوده و سطح تماس زياد باشد. چنين سطح زیادی سبب می شود که تعادل جسم در دو فاز سريع تر انجام شود.

شکل ۴: تصویر اجزاء دستگاه انواع کروماتوگرافی ستونی، کاغذی و لایه نازک.

• کروماتوگرافی کاغذی: کروماتوگرافی کاغذی شامل قراردادن یک نقطه یا خط کوچک از محلول نمونه روی نوار کاغذ کروماتوگرافی است. کاغذ در یک ظرف با مقدار کم حلال قرارداده می شود و در ظرف بسته می شود . هر چه حلال از طریق کاغذ بالا می‌رود، به مخلوط نمونه رسیده و شروع به حرکت به سمت بالا می‌کند. این کاغذ از جنس سلولز که یک ماده قطبی بوده ساخته شده است. رنگ‌هایی که از ترکیبات نمونه حاصل شده از هم جدا شده و به صورت خط‌های رنگی ظاهر می شوند.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی کاغذی :

۱) کاغذ

۲) قیچی

۳) لیوان شفاف

۴) ماژیک رنگی

۵) آب

• کروماتوگرافی لایه نازک( TLC) : کروماتوگرافی لایه نازک یک روش جداسازی ساده، انعطاف پذیر، حساس و با هزینه ای مناسب برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی مواد حتی در مقادیر بسیار کم می باشد. تکنیک TLC قابلیت اندازه گیری موازی و همزمان بسیاری از مواد را در حداقل زمان مورد نیاز، دارد و می تواند به صورت دستی نیز انجام شود. این روش شبیه به کروماتوگرافی کاغذی است اما در این روش از یک لایه نازک و یکنواخت سیلیکاژل یا آلومینا که روی یک قطعه شیشه ای، فلزی یا پلاستیک سخت کاری شده پوشش داده شده اند، به عنوان فاز ثابت استفاده می شود.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک :

۱) صفحات (فاز ثابت یا فاز ساکن)

۲) فاز متحرک (حلال)

۳) فاکتور بازداری: این ضریب برابر با فاصله طی شده توسط جز مورد نظر تقسیم بر فاصله طی شده توسط حلال می باشد.

۴) محفظه یا تانک: TLC یک ظرف شیشه ای با دهانه پهن مناسب است. این محفظه باید حاوی میزان حلال کافی باشد.

تقسیم بندی از منظر مکانیسم جداسازی

• کروماتوگرافی تعویض یونی: کروماتوگرافی تبادل یونی از انواع کروماتوگرافی های جذب شونده می باشد که در آن به طور کلی از رزین به جای جاذب استفاده می‌ شود. تفکیک و جداسازی در واقع در ستونی که با یک ماده تعویض یونی پر شده است (ستون پلیمری که عموما از جنس رزین است)، انجام می شود. ماده پر کننده ستون را فاز ثابت و حلالی که از ستون کروماتوگرافی عبور می کند را فاز متحرک می گوییم.

اجزاء دستگاه کروماتوگرافی تعویض یونی :

۱) فاز متحرک مایع

۲) فاز ساکن

۳) رزین‌ها (جاذب‌های مصنوعی): از ذرات پلیمری کروی ساخته شده‌اند، که دارای ساختار با تخلخل های زیاد هستند.

۴) یون‌های آنالیت: تعویض یون‌های آنالیت با یون‌های رزین زیرا استفاده از رزین با بار مثبت توانایی جذب پروتئین باردار شده منفی را دارد و می‌تواند آن را جداسازی کند.

انواع آشکارساز ها در کروماتوگرافی 

آشکارساز ها در کروماتوگرافی گازی(CG) چهار نوع هستند :

1. یونش شعله‌ای(FID) : آشکارساز یونش شعله (FID) یک ابزار علمی است که مواد مورد برسی در آنالیز را در یک جریان گاز اندازه‌گیری می‌کند. این ابزار بیشتر مواقع در کروماتوگرافی گازی به عنوان آشکارساز (دتکتور) مورد استفاده قرار می‌گیرد.
2. هدایت حرارتی (TCD) : این نوع آشکارساز به افزایش دما واکنش نشان می‌دهد. هر آشکارساز حرارتی با توجه به شرایط محیطی دارای سطح پوشش معینی است.
3. نورسنج شعله‌ای (FAES): نوعی آشکارساز که به گونه ای طراحی شده که به وجود یک شعله یا آتش واکنش نشان می دهد.
4. الکترون گیر (ECD): این نوع آشکارساز بر اساس میزان کاهش جریانی از الکترونها که توسط اجزای الکترون گیر جذب می‌شود عمل می کند.

آشکارساز ها در کروماتوگرافی مایع (HPLC) پنج نوع اصلی هستند :

1. آشکارساز (UV-Vis):  با تابش نور UV به سلول آشکارساز، بخشی از نور UV توسط نمونه جذب می شود و مابقی از آن عبور می کند.
2. دتکتور (PDA): استفاده از آشکارساز (PDA) در کروماتوگرافی مایع، امکان تعیین مناسب ترین طول موج، بدون تکرار آنالیز را به راحتی فراهم می کند.
3. آشکارساز (Rl): آشکارساز (Rl) برای مواردی که حلال در نور فرابنفش جذب دارد و از آشکارساز UV بر روی دستگاه HPLCنمی توان استفاده کرد مناسب می باشد.
4. آشکارساز (ELSD): نمونه های آنالیز توسط آشکارساز (ELSD) معمولا حاوی چربی، شکر و مواد با وزن ملکولی بالا می باشند. عملکرد آشکارساز (ELSD) تقریبا مشابه آشکارساز (RI) می باشد اما حساسیت تشخیصی بالاتر و پایداری مناسب تری دارد.
5. آشکارساز (MS): با استفاده از آشکارساز اسپکترومتر جرمی روی کروماتوگرافی مایع علاوه بر تشخیص ساختار برای تعیین مقدار ترکیبات ملکولی و عنصری با حد تشخیص بسیار پایین استفاده می شود.

کاربردهای کروماتوگرافی 

کروماتوگرافی یکی از روش های آنالیزی بسیار پر کاربرد در صنایع مختلف و همچنین پروژه های تحقیقاتی می باشد. در ادامه به برخی از این صنایع اشاره می شود :

• صنعت داروسازی : با استفاده از کروماتوگرافی ناخالصی ها و ترکیبات دیگر در نمونه دارو مشخص می شود. علاوه بر این، خلوص نمونه دارویی را می توان با کمک این روش تجزیه و تحلیل کرد.
• صنایع شیمیایی : تشخیص وجود آلاینده های سمی در روغن ها، مشخص کردن خلوص نمونه آب و نمونه های هوا.
• صنایع غذایی : تعیین وجود مواد افزودنی شیمیایی و مقدار آن ها و هم چنین نشان دادن میزان باکتری ها در مواد غذایی
• صنایع آرایشی بهداشتی : تشخیص غلظت مجاز ترکیبات مختلف در محصولات آرایشی و بهداشتی که با پوست تماس دارند.
• صنایع کشاورزی : ارزیابی مقدار باقیمانده انواع سموم آفت‌کش بر روی محصولات کشاورزی و شناسایی انواع سموم و آفت کش ها در صنعت کشاورزی.
• آزمایشگاهای تشخیص طبی (صنایع سلامت) : برای آنالیز آمینواسیدها، پروتئین ها، کربوهیدرات ها، لیپیدها، نوکلیئک اسیدها و ترکیبات وابسته به آنها و هم چنین ویتامین های محلول در آب وچربی در نمونه های بیولوژیک مانند خون، ادرار و سایر مایعات در بدن انسان.
• محیط زیست : آنالیز انواع آلاینده های محیطی در آب و پساب های صنعتی.