آزمون سمیت شناسی به روش MTT

آزمون سمیت شناسی به روش MTT

آنالیز MTT یکی از مرسوم ترین روش ها برای مطالعه برون تنی سمیت مواد و داروها است. در این روش پس از کشت سلول های سالم یا بیمار همچون سلول های سرطانی و تیمار آنها با نمونه در غلظت های مشخص، ماده MTT به عنوان شناساگر به سلول ها اضافه می شوند. به صورت کلی این ماده با اثر متابولیسم سلول های زنده تولید بلورهای بفنش رنگ فومازان می کند. با اندازه گیری شدت این رنگ می توان به تخمینی از درصد سلول های زنده رسید.

مبانی روش MTT

در قدیم بررسی تکثیر سلولی به وسیله شمارش سلول پس از رنگ آمیزی آن با یک رنگ حیاتی صورت می گرفت. به عنوان مثال رنگ آمیزی توسط تریپان بلو روشی ساده برای بررسی یکپارچه غشا سلول  و در نتیجه تعیین زنده مانی یا مرگ سلول  است. اما این روش حساسیت کافی را ندارند و برای آنالیزهای در مقیاس زیاد کارایی ندارد. آزمون های سمیت سنجی برای مطالعه زنده مانی و یا تکثیر سلولی را می توان به چهار دسته تقسیم بندی کرد:

۱- آزمون های بر پایه تولید: روشهایی که تعداد سلول های دارای قابلیت تشکیل کلونی در محیط آزمایشگاه را می سنجند. در این مطالعات سلول ها در دانسیته کم کشت دادهمی شوند و تعداد کلونی های تشکیل شده در زمان های معینی شمرده می شوند.این روش بسیار زمان بر است و هنگامی که تعداد نمونه ها زیاد باشد پاسخگو نیست.

۲- آزمون های بر پایه نفوذ پذیری: رو شهایی که ار رنگ های آسیب زننده و نشت کننده به داخل سلول استفاده می کنند و سلول هایی که اجازه ورود رنگ به داخل خود را نمی دهند شمرده می شوند. این سلول ها می تواندد به صورت دستی توسط رنگ آمیزی ترپان بلو و هموسایتومتر شمرده شوند که روشی سریع و ارزان بوده و تنها بخش کوچکی از کل جمعیت سلولی مورد نیاز است.

۳- آزمون های بررسی مستقیم تکثیر: این آزمون ها از سنتز DNA به عنوان شاخصی از تکثیر سلول استفاده می کنند و با اندازه گیری آنالوگ های نوکلئوتیدی رایواکتیو یا غیررادیواکتیو که وارد DNA می شوند، سنجش را انجام می دهند. 

۴- آزمون های بررسی فعالیت متابولیکی: فعالیت متابولیکی سلول با افزودن مک های تترازولیوم به سلول بررسی می شود. این نمک ها توسط سلول های زنده به کریستال های فرمازان که ماده ای رنگی است و می تواند توسط اسپکتروفوتومتر کمی می شود، تبدیل می شوند. سلول های آسیب دیده توانایی تولید و نگهداری انرژی به منظور رشد و عملکرد متابولیکی سلولی را ندارند. معمولا این فعالیت تابولیک با مطالعه فعالیت میتوکندری توسط مواد رنگ زا مانند MTT، MTS، XTT و WST-1 بررسی می شود.

برای مطالعه بیشتر  کتاب مقدمه ای بر روش های ارزیابی در مهندسی بافت، نوشته نفیسه بحیرایی، رعنا ایمانی و فهیمه خیاطان، انتشارات جهاد دانشگاهی منبع مناسبی است.

همان گونه که بیان شد، یکی از روش های مرسوم و سریع برای سنجش میزان سمیت داروها، روش MTT است که اساس آن تشکیل رنگ فورمازان به دلیل احیای ترکیبMTT (دی متیل تیازول – 2 و 5 دی فنیل تترازولیوم برمید) و یا دیگر نمک‌های تترازولیوم است. با گسستگی حلقه تترازولیوم از طریق آنزیم‌های میتوکندریایی در سلول‌های زنده، بلورهای فورمازان غیر محلول تشکیل می‌شود که بنفش رنگ می باشند. ایجاد این بلورها حاکی از فعال بودن آنزیم‌های زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلول‌ها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط اسپکتوفتومتر در طول موج‌های معین می‌توان درصد سلول‌های زنده  مانده را مشخص کرد. این درصد به صورت محاسبه می شود:

۱۰۰ × جذب متوسط نمونه‌های کنترل / جذب متوسط نمونه‌های تیمار شده = درصد سلول‌های زنده

روش کار

روش کار  به این صورت بوده است که در هر چاهک ظرف‌های ۹۶ خانه، حدود ۱۰۰۰۰ سلول از رده سلولی مورد نظر را کشت داده و آن را برای ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس سلول‌های هر خانه را با داروی مورد نظر و در غلظت مشخص تیمار می‌کنیم. محلول‌های محیط کشت حاوی نانوذرات قبل از استفاده ببا استفاده از اولتراسونیک حمامی، سونیکیت شده‌اند. پس از تیمار  در زمان معین محیط سلول‌ها را تعویض کرده و ترکیب MTT را به سلول‌ها اضافه کرده و برای ۳ ساعت و در تاریکی در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس محیط حاوی MTT را حذف و برای حل شدن کریستال‌های فورمازان ۱۰۰ میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه کرده و پلیت را شیک می‌کنیم. جذب نمونه‌ها در ۵۷۰ نانومتر و با رفرنس فیلتر ۶۳۰ نانومترتوسط دستگاه الایزاریدر انجام شده است. 

نمونه ای از جواب نهایی آزمون MTT به صورت زیر است. محور عمودی درصد زنده ماندن سلول ها را نشان می دهد. در این نمونه با افزایش غلظت ماده میزان زنده مانی کاهش یافته است. در مهامکس نتایج با حداقل سه بار تکرار و به صورت نمودار ستونی گزارش می شود. همچنین گزارش های آماری نیز انجام شده و اگر نمونه دارای IC50 باشد، این مقدار و نمودار آن نیز گزارش می شود.

در این آنالیز مشخص کردن پارامترهای زیر قبل از انجام آزمون ضروری است:

• رده سلولی مورد مطالعه: نرمال یا سرطانی
• تعداد سلول های کاشته شده در هر خانه از پلیت
• زمان تیمار: عموما در زمان های ۲۴، ۴۸و ۷۲ ساعت
• روش آماده سازی نمونه و استریل کردن آنها