تعیین مواد عطری و فرار در محصولات آرایشی و بهداشتی با استفاده از آنالیز کروماتوگرافی

تجزیه و تحلیل ترکیب عطر در گیاهان معطر و محصولات طبیعی برای بررسی کیفیت و ایمنی آنها موضوع مهمی است، به ویژه هنگامی که چنین موادی برای استفاده طولانی مدت مانند محصولات آرایشی و بهداشتی در نظر گرفته شده باشند. توسعه ابزارهای تحلیلی سریع، جامع و مؤثر برای تجزیه و تحلیل اسانس ها و تعیین مواد عطری و فرار در چنین مخلوط های پیچیده ای (به عنوان نمونه در مورد مواد مغذی یا آرایشی) مورد توجه است. مطالعات جامع مواد فرار و عطری را می توان از طریق روش جداسازی کروماتوگرافی چند بعدی با آشکارسازهای انتخابی به عنوان طیف سنج جرمی به دست آورد.

این استراتژی تجزیه و تحلیل با کارایی بالا و جهانی صدها متابولیت (در علم بیوشیمی مواد شرکت‌کننده در یک ماده را متابولیت می نامند. در واقع متابولیت‌ها ترکیبات واسطه محصول می باشند این عبارت معمولاً به مولکول‌های کوچک شرکت‌کننده در مواد اشاره دارد) را در یک مرحله امکان پذیر می کند. روش‌های شیمی‌سنجی مختلف که برای آنالیز  اعمال می‌شوند بخش اساسی بررسی برای تعیین مواد عطری و فرار در مواد آرایشی و بهداشتی را تشکیل می‌دهند. علاوه بر این، کاربردهایی از کروماتوگرافی برای کنترل کیفیت و تشخیص تقلب و ناخالصی موجود در مواد آرایشی و بهداشتی مختلف استفاده می شود.

کاربردهای آزمایشگاهی و صنعتی کروماتوگرافی در تعیین مواد عطری و فرار محصولات آرایشی و بهداشتی

• کروماتو گرافی گازی (GC): سیستم‌های کروماتوگرافی گازی کمک قابل توجهی به غلبه بر بسیاری از مشکلات در تشخیص مواد فرار در محصولات آرایشی و بهداشتی کرده‌اند و اشکالات اصلی دیگر آنالیزهای معمولی به‌ویژه برای نمونه ‌های بسیار برطرف می‌کنند. بـه دليل پيچيده بودن اغلب مواد، براي جداسـازي آنهـا مـي تـوان از سـتون هـايي بـا قابليت جداسازي بالا نظير ستون هاي موئين (ستون هایی که دارای قطر داخلی چند دهم میلی متر هستند ستون های مویین نامیده می شوند) استفاده نمود. اسـاس جداسـازي بـه وسيله كروماتوگرافي گازي بر پايه توزيع نمونه بين دو فاز استوار است.

يكي از اين فازها عبارت است از بستر ساكن به صورت ذراتي با سطح بسيار زيـاد و فـاز ديگـرگازي است كه از ميان اين بستر ساكن و بی تحرک مي گذرد. پس كروماتوگرافي گازي روشـي براي جداسازي مواد فرار با گذراندن يك جريان گازي از روي فاز ساكن است. در تجزيه كيفي به وسيله كروماتوگرافي گازي، ابتدا زمان هاي بازداري (زماني كه طول مي كشد تا يك ماده معين از محل تزريق به آشكارسـاز برسـد که معمولا برحـسب دقيقه) يا حجم هاي بازداري (حجمي از گاز بي اثر یا نجیب كه براي عبور يك ماده معين از نقطه تزريق به آشكارساز مورد نياز است) اجزاي نمونه اندازه گيري شـده و سـپس مقدار آن با زمان هاي بازداري يا حجم هاي بازداري تركيبات اسـتاندارد كـه تحـت شرايط مشابه اندازه گيري شده است، مقايسه مي شود. در ادامه تصویری از طیف خروجی آنالیز GC در مورد یک نمونه از لوازم آرایش نشان داده شده است.

تصویر طیف خروجی نوعی لوازم آرایشی با دستگاه کروماتوگرافی گازی

توضیح تصویر: منحنی ها ارتباط میان سرعت جریان خطی گاز حامل و بازدهی و کارایی ستون را به بهترین صورت ممکن نشان می دهد. یکی از نتایج سودمندی که از منحنی ها قابل استخراج است، سرعت جریان بهینه گاز حامل است. با چنین سرعتی کارایی سیستم کروماتوگرافی حداکثر خواهد شد. همچنین از نمودار می توان دانست که دامنه تغییرات مجاز سرعت گاز حامل چقدر است. محور X - زمان ماند اوج (Rt) را نشان می دهد، این از زمان تزریق نمونه به ستون ( t 0 ) تا رسیدن به آشکارساز محاسبه می شود. هر پیک نشان دهنده آنالیت دارای زمان ماندگاری است که از راس پیک اندازه گیری می شود. محور Y  پاسخ آشکارساز را نشان می دهد، این پاسخ اندازه گیری شده پیک آنالیت را در آشکارساز نشان می دهد.

• كروماتوگرافي گازي - طيـف سـنجي جرمـي (GC/MS): کروماتو گرافی گازی همراه با طیف سنجی جرمی (GC-MS) گسترده ترین پلتفرم تحلیلی است که برای تعیین و تشخیص مواد فرار و عطری به کار رفته در محصولات آرایشی و بهداشتی استفاده می شود. اصل عملیات کروماتوگرافی گازی با استفاده از یک ستون مویرگی منفرد (ستون هایی که دارای قطر داخلی چند دهم میلی متر هستند ستون های مویین نامیده می شوند) توسط دو ویژگی اساسی هدایت می شود، شامل ۱) حداکثر ظرفیت و گزینش پذیری مواد و ۲) همچنین نوسانات اجزای نمونه مورد بررسی است. به هنگام استفاده از كروماتوگرافي گازي به وسيله يك عامل تشخيص زمـاني مي توان نمونه مورد استفاده را با يك اسـتاندارد كـه پـس از آن از سـتون معينـي عبور داده شده است، مقايسه نمود. براي اطمينان بيشتر همـراه بـا كرومـاتوگرافي گازي از ساير وسايل تشخيص نيز استفاده مي شود که مجموعـاً يـك وسـيله بـسيار دقيق را تشكيل مي دهند. امروزه استفاده از طيف سـنج جرمـي بـه عنـوان دتكتـور (آشکارساز) براي كروماتوگرافي گازي بسيار متداول است.

آنالیز GC-MS

مزیت استفاده از آشکارساز جرمی در کروماتوگرافی گازی

خواص فیزیکی و شیمیایی آنالیت توسط آشکارساز حس می شود و این خواص به سیگنال تبدیل می شود و کروماتوگرام تولید می کند. برخی از مزایای مهم شامل: پاسخ تکرارپذیر با ایجاد تغییر در گاز حامل، حساسیت بالا، محدوده دینامیکی خطی گسترده، ایجاد نویز پایین، حجم پایین برای جلوگیری از گسترش پیک ها وآشکارساز غیرتخریبی می باشد. 

• کروماتو گرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC): در صنایع آرایشی از HPLC برای سنجیدن و کنترل کیفی مواد آرایشی گوناگون مانند ماتیک ها ،کرم ها ، پماد ها و ... استفاده می شود. کروماتوگرافی مایع با بازده بالا (HPLC) برای سال ها به صورت گسترده به عنوان یک روش تجزیه ای و ابزار کلیدی برای جداسازی و آنالیز مواد مختلف، پایش و تضمین کیفیت مواد آرایشی  وبهداشتی مورد استفاده قرار گرفته است. HPLC به صورت معمول برای جداسازی و آنالیز ترکیبات فرار مورد استفاده قرار می گیرد. در HPLC دو اصطلاح HPLC فاز معکوس (Reversed Phase HPLC) و HPLC فاز نرمال (Normal Phase HPLC) بسیار متداول است. در روش HPLC فاز نرمال یا NP-HPLC از فاز ساکن قطبی و فاز متحرک غیر قطبی استفاده می شود. بنابراین، فاز ساکن معمولا از نوع سیلیکا و فاز متحرک یک ماده غیر قطبی مانند هگزان، متیلن کلراید،کلروفورم ، دی اتیل اتر و یا مخلوطی از آن ها است بدین ترتیب ترکیبات با قطبیت بیشتر روی سطح قطبی ستون به مدت طولانی تری نگه داشته می شوند، در حالی که مواد با قطبیت کمتر به دلیل بر هم کنش کمتر با فاز ساکن، به مدت کوتاه تری برای عبور از میان فاز ساکن نیاز دارند.

آنالیز HPLC

• کروماتوگرافی گازی دوبعدی Two dimensional gas chromatography: کروماتوگرافی گازی دوبعدی با استفاده از دو ستون قرار داده شده به صورت سری (متوالی)، بر تداخل های ناشی از ترکیب های مشترک اجزای نمونه غلبه می‌کند و جداسازی بهتری را در زمان‌های اجرا کمتر با ظرفیت بالاتر و حساسیت جرمی بیشتر ارائه می‌دهد که منجر به تشخیص قابل اطمینان‌تر مواد فرار و عطری می‌شود. با توجه به این که قدرت تفکیک نمونه در این روش افزایش یافته استنباط می شود که توسط این تکنیک، شانس بیشتری برای تشخیص و شناسایی عوامل فرار آنالیت های جزئی مواد و محصولات  و کنترل کیفیت (QC) بوجود می آید.
• کروماتوگرافی گازی تشخیص یونیزاسیون شعله (GC-FID) : این روش یک تکنیک تحلیلی است که برای جداسازی و تجزیه و تحلیل مخلوط های متشکل از اجزای فرار استفاده می شود. GC-FID به ویژه در تشخیص و تعیین کمیت ترکیبات آلی، مانند اسیدهای چرب در غذا و اسیدهای رزینی در آب مفید است. آشکارساز یونش با شعله (FID) بسیار حساس بوده و پاسخ آن دقیق و قابل اعتماد است. این آشکارساز دارای یک شعله هوا – هیدروژن است که در یک میدان الکترواستاتیکی قطبی می‌شود. هنگام کار، شعله محترق می ‌شود ( آتش می گیرد) و نمونه را که همراه با گاز حامل از میان آشکارساز عبور می‌ کند می ‌سوزاند. سپس یون های تشکیل‌ شده (عمدتاً ترکیبات کربن) در الکترودها جمع ‌آوری می ‌شوند و جریانی را ایجاد می ‌کنند. FID به کربن های کاملاً اکسیژن‌ دار مانند کربونیل ‌ها، کربوکسیلیک اسیدها، یا ترکیبات گوگرددار آن ها پاسخ مناسبی نمی‌دهد. اما نکته مثبت این است که به مواردی از قبیل آب و گازهای N₂، O₂، CO₂ و غیره نیز پاسخی نمی ‌دهد. در نتیجه، این آشکارساز برای مطالعه نمونه‌ های مرطوب یا نمونه‌ های آتمسفری بسیار مناسب است. و می توان از این روش برای تعیین مواد فرار و عطری موجود در لوازم آرایشی و بهداشتی استفاده کرد. پاسخ این آشکارساز با تعداد اتم های کربن در ترکیب مورد آنالیز متناسب است، اما با افزایش هالوژن ها، آمین ها و گروه های هیدروکسیل شدت پاسخ کاهش می‌ یابد. 

مقایسه دو روش کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی گازی دو بعدی

 بنابر آزمایشات انجام شده اتخاذ کروماتوگرافی گازی دو بعدی در تجزیه و تحلیل اسانس ها و مواد فرار می تواند دانش عمیق تری از ترکیب مواد و محصولات را  نسبت به جداسازی آنالیت ها از طریق کروماتوگرافی گازی (CG)حاصل کند. علاوه بر این، کروماتوگرافی دو بعدی  امکان  شناسایی و طبقه‌بندی نمونه‌های متمایز را فراهم می‌کند و تعیین مواد فرار را تسهیل می‌کند.

 مزایای کروماتو گرافی مایع با عملکرد بالا ( HPLC )                 

HPLC آماده سازی یک روش سریع، انعطاف پذیر و دقیق برای جداسازی ترکیبات از محصولات پیچیده با خلوص بالا است. این تکنیک به دلیل اندازه ذرات کوچکتر سیلیس و دیگر دلایل، وضوح بهتری نسبت به کروماتوگرافی های دیگر دارد. اندازه فاز ساکن، در حدود ۵ تا ۱۵ میکرومتر، منجر به سطح بزرگتری می شود که  نمونه های مورد بررسی می توانند در زمان بیشتر با آن تعامل داشته باشند. این تعامل بهبود یافته بین فاز متحرک و ثابت وضوح را افزایش می دهد. نوع فاز ثابت و فاز متحرک یا حلالی که هنگام ساخت محصولات آرایشی انتخاب می شود  همانطور که انتظار می رود، ماده ای که برای جداسازی محصولات طبیعی با کروماتوگرافی انتخاب می شود به نوع ترکیبات موجود و فرآیند استخراج بستگی دارد. به عنوان مثال، عصاره گیاهی که با اتانول آبی به دست می‌آید به طور قابل ملاحظه‌ای با ترکیبات استخراج‌شده با هگزان متفاوت است.

تعیین مواد فرار با استفاده از دو روش کروماتوگرافی ستونی و HPLC

کروماتوگرافی ستونی برای خالص سازی مقادیر زیاد محصولات مصنوعی و طبیعی مناسب است. این یک تکنیک ایده آل برای تفکیک سریع عصاره های خام درشت است. هنگامی که ما از کروماتوگرافی ستونی استفاده می شود، هدف اصلی این است که فعال ترین بخش ها را در مخلوط آشکار کنیم تا بتوان فعالیت های زیستی آنها را با مولکول هایی که از آنها ساخته شده اند مرتبط کرد. برای جداسازی مواد فعال، نمونه را می توان با بارگذاری مایع یا جامد به ستون وارد کرد. به طور معمول، از سیلیس فاز معمولی یا فاز معکوس با محدوده اندازه ذرات ۱۵ تا ۵۰ میکرومتر به عنوان فاز ساکن استفاده می کنیم. اغلب،  نیاز به جمع آوری چندین بخش برای شناسایی بیشتر و خالص سازی بیشتر توسط HPLC است. فرایند HPLC ، این روش معمولا در مرحله نهایی خالص سازی مواد آرایشی و بهداشتی استفاده می شود. برای این تکنیک، اغلب نمونه را از طریق بارگذاری مایع روی یک ستون فولادی با سیلیس به عنوان فاز ساکن تزریق می شود.

آماده سازی نمونه آرایشی بهداشتی برای کروماتوگرافی

 آماده سازی نمونه مورد برسی بر فرایند کروماتو گرافی تاثیر مثبت دارد لذا حذف اجزای قطبی از نمونه، کروماتوگرافی را ساده می‌کند و احتمال تداخل اجزای ترکیبات را کاهش می‌دهد و اجزایی را که به طور بالقوه می‌توانند روی برسی و تعیین مواد فرار تاثیر بگذارند حذف می‌کند. از آب برای رقیق کردن نمونه های مایع (مانند تونیک های صورت، دهان شویه ها، تونیک ها، اسپری های بدن، محلول های تزریقی و آب رسان ها) استفاده می شود. نمونه های جامد (مانند خمیردندان ها، کرم ها، ماسک ها و پمادها) و نمونه های مایع با چگالی و ویسکوزیته بالا (مانند ژل ها، شربت های متراکم و روغن ها) باید به صورت کمی مورد برسی قرار گیرند. روش های زیادی مورد آزمایش قرار گرفتند از جمله تکان دادن نمونه ها با حلال های مختلف و سانتریفیوژ با این حال، استخراج اولتراسونیک موثرترین بوده است. با این حال، استخراج اولتراسونیک موثرترین بود. حلال های متعددی با این روش مورد آزمایش قرار گرفتند (متانول، اتانول، اتیل استات، استون، استونیتریل و متیلن کلراید). شرایط برای سطوح مختلف محیط با PH های مختلف و زمان های مختلف استخراج (۵، ۱۵، ۴۵ و ۹۰ دقیقه) انجام گردید. برای هر نمونه روشی که بیشترین بازیابی را به همراه دارد استفاده می شود. در تجزیه و تحلیل نمونه های تجاری، سه مقدار (۱ گرم) از هر نمونه با روش بهینه شده قرار گرفتند. نمونه های با غلظت آنالیت بالا با آب (خمیر، ژل و شربت) یا متانول (کرم و لوسیون بدن) رقیق شدند. نمونه های رقیق نشده دو بار  مورد آنالیز و برسی قرار گرفته اند.

نتایج تجزیه و تحلیل نمونه های آرایشی و بهداشتی

روش تحلیلی بهینه برای تجزیه و تحلیل تمام نمونه های تجاری لوازم آرایشی و بهداشتی استفاده شد و شناسایی ترکیب ها  بر اساس روش استاندارد افزودن ، مقایسه و نگهداری آنالیت است. در نتیجه برسی لوازم آرایشی و بهداشتی غلظت آنالیت های منفرد در نمونه های تجاری از محدودیت های قانونی نباید بیشتر شود.

روش های تحلیلی با استفاده از کروماتو گرافی به طور همزمان و با دقت بالا ترکیبات فرار و مواد عطری را در لوازم آرایشی تعیین می کند. ترکیبات رایج و نگهدارنده های مورد استفاده در محصولات موجود در بهینه شده هستند که مراحل بهینه سازی آن ها علاوه بر زمان بر بودن نیاز به دستگاه ها و تجهیزات و نیروی متخصص آموزش دیده دارد. روش های کروماتو گرافی را می توان برای کنترل کیفیت لوازم آرایشی و بهداشتی و  تخمین پایداری محصول ( کوتاه مدت و بلند مدت بودن آن) استفاده کرد. هم چنین گزارش شده است که محصولات آرایشی و بهداشتی مورد استفاده روزانه حاوی انواع ترکیبات آلی فرار و مواد عطری گوناگون هستند. تجزیه و تحلیل این مواد فرار و عطری با روش  GC-MS برای نمونه‌های محصولات بهداشتی انجام شده است نشان می دهد که این محصولات حاوی ترکیبات بسیار سمی خاصی در سطوح هشدار دهنده است. لذا یافتن جایگزین های سازگار با محیط زیست و مناسب برای سلامت انسان در حال پیگیری از سمت شرکت ها و صنایع آرایشی و بهداشتی است که می تواند مواد سمی موجود در محصول های آرایشی و بهداشتی را کاهش داده یا آن ها را به طور کامل حذف کند .