آشنایی با فلوسایتومتری و کاربرهای آن

پیشرفت در تحقیقات علوم پزشکی و زیست شناسی به منظور بررسی موجودات زنده و مولکول‌های تشکیل‌دهنده آن‌ها به ابزار قدرتمندی جهت آنالیز عملکرد سلول‌ها نیاز دارد. استفاده از روش‌های میکروسکوپی همراه با روش‌های رنگ‌آمیزی سلول‌ها هنوز هم یکی از ابزارهای دستیابی به اطلاعاتی پیرامون فعالیت، تکثیر و تمایز سلول‌ها است. امروزه استفاده از سیستم‌های میکروسکوپی موجود که براساس غلظت‌های نوری کار می‌کنند، به دلیل کند بودن مناسب نیست و نیاز به روش‌های پیشرفته‌ای است که در زمان کوتاه و با سرعت بالا قادر باشند تا به تجزیه و تحلیل سلول‌ها بپردازند. پیدایش فناوری فلوسایتومتری و یا بررسی سریع و دقیق سلول‌های رنگ شده بین سال‌های 1956 تا 1970 با ترکیب اندازه‌گیری‌های الکترونیک و عبور جریان کوچکی از سلول‌ها ایجاد شد و امروزه منجر به شکل‌گیری دستگاه‌های مجهزی جهت بررسی، ارزیابی و جداسازی سلول‌ها شده است.

آزمون فلوسایتومتری

اصول فلوسایتومتری

همانطور که از نام فلوسایتومتری (Flow cytometry) معلوم است، فلوسایتومتری بررسی سلول‌های منفرد در جریانی از مایع است. این جریان مایع، جهت انتقال ذرات و سلول‌ها به صورت منفرد عمل می‌کند. در حقیقت فلوسایتومتری، فناوری‌ای است که در آن به طور همزمان چندین ویژگی فیزیکی یک ذره مثل سلول، حین عبور جریان مایع حاوی سلول‌ها از مقابل نور لیزر، اندازه‌گیری و تجزیه و تحلیل می‌شود. مکانیسم عمل دستگاه فلوسایتومتری، عبارت است از تمرکز نور بر روی سلول‌ها و ضبط خصوصیات فلورسانس و پراکنش حاصل از آن‌ها.

اجزای اصلی یک دستگاه فلوسایتومتری

یک دستگاه فلوسایتومتر از 3 قسمت اصلی تشکیل شده است:

شکل 1: شمایی ساده از دستگاه فلوسایتومتر و نحوه عملکرد آن

1. سیستم مایع که ذرات و سلول‌ها را به صورت شناور در جریانی مایع از مقابل نور لیزر عبور داده و بستری برای حمل آن‌ها فراهم می‌آورد.
2. سیستم نوری شامل لیزرهایی است که به ذرات و یا سلول‌هایی که در جریان مایع غلافی (Sheath Fluid) عبور می‌کنند، نور می‌تاباند و همچنین شامل فیلترهای نوری است که نور حاصله را به سمت آشکارسازهای نوری مناسب هدایت می‌کند.
3. سیستم الکترونیکی امواج گرفته شده توسط آشکارسازها (detectors) را به سیگنال‌هایی تبدیل می‌کند که با کامپیوتر قابل تجزیه و تحلیل باشند.

بدین ترتیب وجود یک منبع نوری، مجموعه‌ای از چندین عدسی جهت تمرکز نور بر فلوسل، ساختارهای نوری جهت متمرکز ساختن بازتابش رنگ‌های مختلف بر روی آشکارسازها و حضور یک بخش الکترونیک جهت بزرگنمایی و پردازش سیگنال‌های حاصل با استفاده از کامپیوتر برای هر نوع فلوسایتومتری ضروری است.

انواع فلوسایتومترها

براساس نوع کار، 2 نوع دستگاه فلوسایتومتر وجود دارد، دسته‌ای که تنها برای آنالیز سلول‌ها به کار می‌رود و دسته‌ی دیگر آن‌هایی هستند که جهت آنالیز و جداکردن سلول‌ها به کار می‌روند. دسته اول، به دلیل سادگی و ارزان بودن، عمده‌ترین نوع فلوسایتومترِ موجود در آزمایشگاه‌های کلینیکی و حتی تحقیقاتی هستند و وظیفه‌ی آن‌ها تشخیص نوع سلول و تعیین میزان آن در خون یا سایر بافت‌ها است. دسته دوم، فلوسایتومترهایی هستند که به عنوان جداکننده سلولی (Cell Sorter)، آن‌ها را می‌شناسند که این‌ها علاوه بر توانایی تشخیص نوع سلول، قابلیت جداسازی آن‌ها را با درجه خلوص بالا را دارند. امروزه از این نوع دستگاه به منظور جداسازی و مطالعه یک دسته سلول ویژه استفاده می‌شود و حتی در مطالعات طب ترمیمی به منظور جداسازی و مطالعه یک دسته سلول ویژه موثر در ترمیم ضایعه‌ی ایجاد شده نیز استفاده می‌شود.

داده‌های حاصل از فلوسایتومتری

داده‌های حاصل از فلوسایتومتری را می‌توان به روش‌های گوناگونی نمایش داد که به طور مختصر درموردشان صحبت می‌کنیم.

شکل 2: حالت‌های مختلف نمایش داده‌های حاصل از فلوسایتومتر

1. هیستوگرام: هیستوگرام‌ها به نمایش تنها یک پارامتر از نمونه می‌پردازند و غلظت نهایی رنگ را به بهترین شکل ممکن ارائه می‌دهند، (میانگین فلورسانس و ضریب تنوع (CV) این نمودارها برای بررسی‌های کمّی فلوسایتومتری مناسب هستند).
2. نمودار نقطه‌ای: نمایش دو بعدی داده‌ها توسط نمودارهای نقطه‌ای صورت می‌گیرد. از آن‌جا که در این نمودارها، هر سلول به صورت یک نقطه نمایش داده می‌شود، لذا جهت ارزیابی‌های اولیه و تعریف حدبندی‌های مورد نظر به کار می‌روند.
3. کانتور: مثل نمودارهای نقطه‌ای، در این نمودارها نیز نمایش داده‌ها به صورت دو بعدی انجام می‌شود. در مقایسه یا نمودارهای نقطه‌ای، این نوع نمودارها حالت‌های بهتری از ارزیابی را ارائه می‌دهند.

هر یک از انواع نمایش داده‌های حاصل از فلوسایتومتر، به منظور مختلفی قابل استفاده است و از هر یک می‌توان موارد مختلفی را بسته به هدف مورد نظر، استنباط کرد.

کاربردهای فلوسایتومتری

امروزه از فلوسایتومتری در تمامی شاخه‌های علوم زیستی جهت اندازه‌گیری ویژگی‌ها، خصوصیات و حتی دسته‌بندی سلول‌های گیاهی، جانوری، مخمرها، باکتری‌ها و حتی هسته‌های آن‌ها، کروموزوم‌ها و میتوکندری‌ها و در کلینیک به منظور تشخیص بیماری‌ها و یا جداسازی سلول‌های اختصاصی به منظور درمان استفاده می‌شود.

به کمک تکنیک فلوسایتومتری، می‌توان اجزای داخل سلولی مثل DNA هسته‌ای، بیان آنتی‌ژن‌های سطحی، بررسی فعالیت آنزیم‌های درون سلولی و حتی اندازه‌گیری pH داخل سلولی، پرداخت.

مزایا و محدودیت‌های تکنیک فلوسایتومتری

از جمله مزایای تکنیک فلوسایتومتری، اندازه‌گیری و بررسی پارامترهای مختلف (اندازه سلول، گرانولیتی، ویژگی‌‌های درونی سلول و در نهایت میزان فلورسانس) هزاران سلول، در عرض چند دقیقه است. این ویژگی‌ها با استفاده از یک سیستم دوگانه نوری – الکترونیکی که پراکنش نور لیزر توسط ذرات و یا فلورسانس بازتابی آن‌ها را ضبط و ذخیره می‌نماید، تعیین می‌گردد. عمده‌ترین نکته منفی دستگاه این است که تنها برای سلول‌های منفرد به کار می‌رود و به طور مثال، این دستگاه قادر به ارزیابی ارتباط سلول‌ها در حالت فضایی نیست.